Objectifs

Les maladies cardiovasculaires athérosclérotiques sont des affections multifactorielles

associées à un état inflammatoire chronique. De nombreux facteurs de risque cardiovasculaire

et du syndrome métabolique dont l’obésité, l’hypertension artérielle, les dyslipidémies, et les

diabètes semblent agir en synergie par des voies de signalisation impliquant de nombreux

médiateurs inflammatoires et des altérations des réponses immuno-inflammatoires. Les

peptides antimicrobiens, les défensines et les cathélicidines, sont considérés comme étant des

effecteurs clés de la défense immunitaire innée, mais aussi des réponses inflammatoires. Ils

ont une activité chimio-attractante, ils régulent l’expression de cytokines inflammatoires, de

chimiokines et de molécules d’adhésion cellulaire. De plus, de nombreuses études ont suggéré

que ces peptides sont associés à des pathologies inflammatoires comme l’athérosclérose.

Néanmoins, la relation entre les peptides antimicrobiens et le risque de maladies

cardiovasculaires athérosclérotiques est très peu étudiée.

Au cours de notre travail, nous nous sommes proposé de répondre aux questions suivantes :

- Existe-t-il un lien entre l’expression des défensines-α et des cathélicidines dans les

cellules immuno-inflammatoires et les facteurs de risque du syndrome métabolique

et des maladies cardiovasculaires ? Quels sont les facteurs biologiques influençant

l’expression de ces peptides ?

- Par quels mécanismes les défensines et les cathélicidines seraient impliquées dans

le risque cardiovasculaire ? Compte tenu du rôle clé de ces peptides dans les

réponses immunes et inflammatoires, existe-t-il une relation entre l’expression des

défensines-α et des cathélicidines et celle du récepteur des molécules

chimio-attractantes, FPR ? Quelle est la place de ce récepteur dans les fonctions

immuno-inflammatoires des défensines-α et des cathélicidines?

- Des études ont rapporté l’existence de liens entre des variations génétiques du

récepteur FPR et certaines fonctions des cellules immuno-inflammatoires.

Existe-t-il des associations entre les polymorphismes génétiques de FPR et les

concentrations des marqueurs d’inflammation (cytokines, molécules d’adhésion,…)

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circulants et l’expression des peptides antimicrobiens dans les cellules

immuno-inflammatoires ?

- L’expression et la mobilisation des défensines-α et des cathélicidines peuvent être

régulées par de nombreux stimuli endogènes et/ou exogènes, influençant ainsi leurs

fonctions biologiques. Quels sont les facteurs pouvant réguler les gènes de ces

peptides dans le contexte du risque de maladies cardiovasculaires, et pouvant

expliquer l’implication éventuelle des défensines-α et des cathélicidines dans le

développement du risque cardiovasculaire ?

Afin d’aboutir à la réalisation de notre objectif et de répondre à nos questions, nous

avons fait appel à deux approches expérimentales différentes et complémentaires :

L’approche épidémiologique en menant des études chez des individus de la cohorte

Stanislas, et l’approche mécanistique en utilisant des modèles cellulaires in vitro.

Ainsi, nos études comportent les trois étapes suivantes :

1) Analyser les relations qui pourraient exister entre l’expression des

défensines-α DEFA1-3 et de la cathélicidine LL-37 et les indicateurs et

facteurs de risque du syndrome métabolique et des maladies

cardiovasculaires.

Nous avons étudié le profil d’expression quantitative des ARNm des gènes de la

cathélicidine LL-37 et des défensines-α DEFA1-3 dans les cellules mononuclées

du sang périphérique (PBMCs) par RT-PCR en temps réel. Les PBMCs

provenaient de 178 sujets adultes (sous-échantillon 1) sélectionnés à partir de la

cohorte STANISLAS. Nous avons ensuite réalisé des analyses de corrélation

Ainsi, l’ensemble des études réalisées dans le cadre de ce travail de thèse a eu pour objectif

général d’étudier les relations qui pourraient exister entre l’expression des gènes des

défensines-α et des cathélicidines et les facteurs de risque du syndrome métabolique et des

maladies cardiovasculaires, et de déterminer les mécanismes par lesquels ces peptides

pourraient être associés au développement du risque cardiovasculaire.

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statistique entre le niveau d’expression des ARNm de LL-37 et des DEFA1-3 et les

valeurs des indicateurs de l’obésité, de la pression artérielle, des taux circulants des

lipides, des lipoprotéines, de glucose et des indices de l’inflammation chez les

individus étudiés.

2) Déterminer la relation éventuelle entre le gène du récepteur des molécules

chimio-attractantes, FPR, et l’expression des défensines-α DEFA1-3, de la

cathélicidine LL-37 et les concentrations de marqueurs d’inflammation

circulants.

Il a été montré que les peptides LL-37 et défensines exercent leur fonction

chimiotactique via des récepteurs de la famille FPRs. Nous avons donc analysé,

dans un premier temps, les corrélations entre l’expression des gènes de LL-37 et

des DEFA1-3 et celle du gène du récepteur FPR (FPR1) dans les PBMCs des

sujets de la cohorte Stanislas (sous-échantillon 1).

Ensuite, nous avons analysé les associations éventuelles entre un variant génétique

du récepteur FPR (FPR1 c.32C>T/p.I11T) et les taux circulants d’une vingtaine de

molécules d’inflammation et d’adhésion cellulaire. Pour ce faire, nous avons

génotypé le polymorphisme FPR1 c.32C>T par la technique de PCR-RFLP

(Polymerase Chaine Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) à

partir des ADN génomiques qui provenaient de 325 individus adultes

(sous-échantillon 2) de la cohorte Stanislas. Nous avons également testé l’effet éventuel

de ce polymorphisme sur l’expression transcriptionnelle des gènes du récepteur

FPR et de LL-37 dans les PBMCs des sujets du sous-échantillon 1.

3) Etudier la régulation des gènes des défensines-α et des cathélicidines dans le

contexte du risque cardiovasculaire en utilisant des modèles cellulaires in

vitro.

En troisième partie de ce travail de thèse, et afin de tenter de comprendre la nature

de la relation éventuelle entre l’expression des gènes de LL-37 et DEFA1-3 et la

variabilité des facteurs de risque cardiovasculaire, nous avons procédé, sur la base

des résultats des études d’associations de la première partie, à l’étude de la

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régulation des gènes des défensines-α et des cathélicidines par des stimuli

athérogènes dans des modèles cellulaires.

Nous avons analysé l’expression du gène de la cathélicidine CRAMP,

l’homologue de la cathélicidine humaine chez la souris, dans la lignée

d’adipocytes murins 3T3-L1. Nous avons testé l’effet de traitement par du glucose

ou/et d’insuline, l’effet de la différenciation adipocytaire, ou encore l’interaction

cellulaire entre les adipocytes 3T3-L1 et la lignée de macrophages humains U-937

sur l’expression des ARNm de CRAMP. Nous avons également analysé l’effet de

traitement par du glucose ou/et d’insuline sur l’expression des ARNm des

DEFA1-3 dans les neutrophiles dérivés des pro-myéloblastes HL-60. L’expression

des ARNm des gènes a été analysée par RT-PCR semi-quantitative.

Les méthodologies et les approches expérimentales utilisées pour la réalisation de nos études

sont présentées en détail dans la section « MATERIEL ET METHODES ».

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Afin d’étudier l’implication des peptides antimicrobiens dans le risque de

développement de maladies cardiovasculaires et du syndrome métabolique, nous avons fait

appel à deux approches de recherche à la fois différentes et complémentaires.

1) L’approche épidémiologique portant sur des études d’association avec le gène ou

les produits du gène d’intérêt à l’échelle des populations

2) L’approche mécanistique portant sur des études de régulation de l’expression de

gènes en utilisant un modèle cellulaire.

Nous avons entrepris ces deux types d’études pour la réalisation du travail effectué

dans le cadre de cette thèse.

Dans le document Peptides antimicrobiens : un lien entre l'immuno-inflammation et les facteurs de risque du syndrome métabolique et des maladies cardiovasculaires (Page 80-87)