Régulation et fonctions des complexes SCF et APC dans le

1.1.3.6.3.1 La progression dans la phase G1 et la préparation à la réplication

La formation des complexes pré-RC est un évènement rigoureusement contrôlé afin que la réplication de l’ADN n’ait lieu qu’une seule fois par cycle cellulaire. L’APCCdh1 _{est un régulateur important de l’étiquettage des origines de}

réplication. Par exemple, la cycline A et la géminine, une protéine inhibitrice de l’assemblage des complexes pré-RC, sont dégradées en mitose et en G1 suite à leur ubiquitination par Cdh1 [119, 120]. L’expression de la géminine est élevée en phase S, G2 et début de mitose lorsque l’APCCdh1 est inhibé et qu’une seconde réplication du génome doit être prévenue. D’un autre côté, l’APCCdh1 ubiquitine le facteur Cdc6 responsable de l’assemblage des complexes pré-RC lorsque les cellules sont en quiescence [110, 121]. Comment la formation des complexes de pré-RC est-elle possible alors que Cdh1 ubiquitine autant des inhibiteurs que des composantes de ces complexes? Une partie de la réponse est venue du groupe de J Diffley. Tandis qu’il est accepté que l’activité CDK intracellulaire élevée prévient la formation de nouveaux complexes de réplication, il a démontré que les CDKs peuvent également la favoriser en phosphorylant Cdc6 [110]. Cette phosphorylation inhibe l’interaction entre Cdc6 et Cdh1 et stabilise ainsi Cdc6. Ceci permet d’expliquer le comportement de Cdh1 envers ses différents substrats pour permettre la formation des complexes pré-RC.

L’APCCdh1 contrôle également l’entrée en phase S en ubiquitinant Skp2 durant la phase G1 [111, 122, 123]. Les niveaux de Skp2 sont très faibles au début de la phase G1, augmentent à partir de la transition G1/S et demeurent élevés jusqu’en sortie de mitose. Notre laboratoire a réalisé une étude, dans laquelle il a été démontré que la dégradation de Skp2 est bloquée de la mi-G1 à la fin de la mitose suite à la phosphorylation de sa sérine 64 par CDK2/cycline E [111]. Cette phosphorylation prévient l’interaction avec Cdh1, comme c’est le cas pour Cdc6. En sortie de mitose et au début de la phase G1, Skp2 est ubiquitinée après avoir été déphosphorylée par la phosphatase Cdc14B.

1.1.3.6.3.2 L’entrée en phase S

Lorsque le complexe CDK2/cycline E est activé à la transition G1/S, il phosphoryle l’inhibiteur du cycle cellulaire p27 sur la thréonine 187 [124, 125]. Cette phosphorylation provoque l’interaction entre p27 et le complexe SCFSkp2 [126, 127]. p27 est alors ubiquitiné, ce qui entraîne sa dégradation et, par le fait même, l’activation encore plus soutenue des complexes CDK2. Bien que Skp2 puisse promouvoir la dégradation de plusieurs protéines (voir Tableau II, p.21), les expériences génétiques suggèrent que p27 est son principal substrat. En fait, dans les MEFs Skp2-/-, il y a une forte accumulation de p27 [128]. Les souris Skp2-/- ont également un phénotype cellulaire complexe : les cellules ont des noyaux plus gros, sont polyploïdes, ont des centrosomes surnuméraires et prolifèrent moins rapidement que les cellules de type sauvage. Tous ces phénotypes sont atténués lorsque p27 est inactivé simultanément à Skp2 [59, 129]. En plus de réguler la transition G1/S, il a été démontré que Skp2, toujours via l’ubiquitination et la dégradation de p27, peut également réguler l’entrée en mitose [59]. Effectivement, dans les cellules Skp2-/-, l’activité de CDK1 est moins élevée que dans les cellules contrôles, ce qui retarde l’entrée en mitose. p27 agit donc à la fois comme inhibiteur de l’entrée en phase S et de l’entrée en mitose.

Au cours de la phase S, l’activité du complexe CDK2/cycline E diminue radicalement, lorsque la cycline E est dégradée par SCFSkp2 indépendamment de sa phosphorylation et par SCFFbw7lorsque la Thr 380 est phosphorylée par CDK2 ou GSK3 [128, 130, 131]. La progression en phase S est assurée en partie par les complexes CDK2/cycline A. L’accumulation de la cycline A en fin de G1 survient lorsque l’APCCdh1 est inactivée [132]. Ceci est effectué par trois mécanismes principaux. Tout d’abord, l’augmentation de l’activité CDK en fin de G1 et au début de la phase S permet la phosphorylation et l’inhibition de l’APCCdh1 [133-135]. Ensuite, il a été proposé que l’ubiquitination de la E2 UbcH10 par l’APCCdh1 en fin de phase G1 constituerait un autre mécanisme inhibiteur [136]. Étant encore un sujet de controverse, le groupe de J. Pines suggère plutôt que UbcH10 serait limitant dans l’activité de l’APCCdh1 en G1, mais que sa dégradation ne représenterait pas un

mécanisme autonome d’inhibition [137]. Finalement, les facteurs de transcription E2F permettent la synthèse de Emi1 au début de la phase S [138]. Emi1 est un inhibiteur qui lie à la fois l’APC et Cdh1, ce qui bloque leur accès aux substrats [139]. Emi1 agit comme un pseudo-substrat grâce à sa boîte D reconnue par Cdh1. L’inhibition de l’APC en fin de G1 permet donc à la cellule d’accumuler les cyclines qui lui sont essentielles pour le déroulement de la phase S et de la mitose.

1.1.3.6.3.3 La progression en mitose

Les premiers substrats de l’APC à être dégradés en mitose le sont dès la prométaphase, bien avant que tous les kinétochores ne soient attachés correctement aux microtubules. L’activation de l’APC en début de mitose est déclenchée suite à la dégradation par le protéasome de l’inhibiteur Emi1 [140]. En mitose, les kinases CDK1/cycline B et Plk1 (Polo-like kinase 1) phosphorylent Emi1 [141, 142]. Ceci a pour effet de créer un site d’interaction avec SCFβ-TrCP qui peut ainsi l’ubiquitiner. Le complexe SCFβ-TrCP est également impliqué dans l’entrée en mitose et dans le point de contrôle en G2 en entraînant la dégradation de Wee1 et Cdc25A (Sections 1.2.1.3.2.1 et 1.2.1.3.2.2) et [115].

La cycline A et la kinase Nek2A (NIMA (Never in mitosis gene a)-related kinase 2A) sont dégradées rapidement au début de la mitose. Des expériences avec Nek2A ont démontré que l’APC n’a pas besoin de coactivateurs pour l’ubiquitiner [143, 144]. Ces observations expliquent comment l’ubiquitination de substrats par l’APC est possible alors qu’il est reconnu que l’APCCdc20 est maintenu inactif par la machinerie du point de contrôle des fuseaux mitotiques. Cependant, l’inhibiteur du cycle cellulaire p21 est, quant à lui, ubiquitiné par Cdc20 dès la prométaphase [145]. Il semble donc que la régulation de l’activité de l’APC soit très complexe et dépende du substrat à dégrader. Des expériences biochimiques effectuées par le groupe de M. Kirshner suggèrent que l’APC a des substrats « processifs » qui sont polyubiquitinés suite à une seule interaction avec l’APC ainsi que des substrats « distributifs » qui requièrent plusieurs cycles d’interaction pour être polyubiquitinés [146]. Cette classification des substrats de l’APC aide à comprendre comment celui-ci parvient

à ubiquitiner ses substrats dans le « bon ordre ».

1.1.3.6.3.4 Le point de contrôle des fuseaux mitotiques

La principale fonction de l’APCCdc20 est d’amorcer la sortie de mitose en permettant la séparation des chromatides sœurs. Pour ce faire, il ubiquitine la cycline B et la Sécurine, un inhibiteur de la Séparase (Figure 1.6) (Section1.2.1.1) et [94]. En plus de l’inhibition par la Sécurine, l’activité de la Séparase est contrôlée négativement par phosphorylation via les CDKs. Lorsque les niveaux de cycline B diminuent à la transition métaphase-anaphase, cette inhibition est levée, rendant la Séparase encore plus active [147]. Lors de la métaphase, il est essentiel que les kinétochores soient attachés aux microtubules qui émanent des deux pôles. Dans le cas contraire, le manque de tension habituellement générée par l’ancrage des kinétochores aux microtubules active le SAC (Spindle assembly checkpoint) (Figure 1.6) [148]. De par son rôle déterminant dans la séparation des chromosomes, le co- activateur Cdc20 représente une cible de choix pour bloquer la mitose lorsque les conditions pour exécuter la ségrégation complète des chromosomes ne sont pas parfaitement remplies. Trois mécanismes, découverts autant chez la levure que chez les mammifères, bloquent Cdc20 lors de l’activation du SAC. Premièrement, l’interaction entre Mad2 (Mitotic arrest deficient 2), BubR1 (Bub1-related kinase) et Cdc20 inhibe l’APC [149, 150]. Il est intéressant de noter que l’expression de Mad2 augmente en G2 lorsque son répresseur transcriptionnel REST (Repressor-element-1- silencing transcription factor) est dégradé par le complexe SCFβ-TrCP [151]. Deuxièmement, le SAC augmente l’activité catalytique de la kinase Bub1 (Budding uninhibited by benzimidazoles 1) qui phosphoryle et inhibe Cdc20 [152]. Troisièmement, chez la levure, la liaison de Mad2 et Mad3 à Cdc20 entraîne l’auto- ubiquitination et la diminution des niveaux protéiques du co-activateur de l’APC [153]. Un tel mécanisme n’a pas encore été démontré chez les mammifères. Comment alors une cellule peut-elle inactiver le SAC lorsque tous les chromosomes sont correctement attachés aux deux pôles? Il semble que la multi-ubiquitination de Cdc20 par l’APC engendre la dissociation de Mad2 et BubR1 de Cdc20 [154], un processus largement contrôlé par l’activité de la E2 UbcH10 et de la dé-ubiquitinase

Usp44 [154]. La balance entre l’activité d’ubiquitination et de dé-ubiquitination est un mécanisme permettant à la cellule de rester alerte et d’inactiver rapidement le SAC pour l’exécution de l’anaphase.

Figure 1.6 Le point de contrôle du fuseau mitotique.

En interphase, le complexe Mad2/Bub3/BubR1 prévient l’activation de l’APC en séquestrant et inhibant Cdc20. En prométaphase, lorsqu’un kinétochore n’est pas bien attaché aux microtubules, la machinerie du SAC, concentrée au kinétochore, est fortement activée par phosphorylation ou changement de conformation. Lorsque tous les chromosomes attachés, le SAC est éteint et l’activation de l’APC engendre la progression en anaphase. Voir le texte pour plus de détails. Figure adaptée de [155].

1.1.3.6.3.5 La sortie de mitose

Pour que les dernières étapes de la mitose soient complétées, l’activité CDK doit être très faible. La dégradation de la cycline B, principale cycline de la mitose, d’abord par l’APCCdc20 et ensuite par l’APCCdh1 abaisse l’activité CDK rapidement.

L’APCCdh1 est la principale E3 ligase active en fin de mitose, alors que Cdh1 est activé par la phosphatase Cdc14 (Section 1.3.1) et [115]. Elle permet la sortie de mitose en ubiquitinant plusieurs substrats, dont les kinases mitotiques Plk1 et Aurora A, la cycline B et Cdc20.