Chapitre V : Matériels et méthodes
V.2 Réactifs et conditions de cultures
Milieux de culture
Deux milieux de culture ont été utilisés; un pour les cellules cancéreuses et un pour les cellules endothéliales.
Les cellules endothéliales sont cultivées en milieu EBM-2 Endothelial Growth
Medium (Clonetics, San Diego, USA). Sa fiche technique est la suivante: milieu qui
contient 500 ml d'Endothelial Basal Medium-2 et les facteurs de croissance suivants: 0,5ml épidermique humain Growth Factor (VEGF), 0,5 VEGF, 0,5ml R3-Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1), 0,5ml d'acide ascorbique, 0,2ml Hydrocortisone, 2ml humain Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β), 25ml de sérum bovin fœtal (FBS), 0,5ml Gentamicine / Amphotéricine-B (GA).
Les cellules cancéreuses sont cultivées en milieu RPMI-1640: Roswell Park
Memorial Institute medium (Invitrogen, Cergy Pontoise, France). Ce milieu RPMI
137 (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) et 10% de sérum de veau foetal décomplémenté. Le sérum de veau fœtal est décomplémenté à 56°C pendant 30 minutes; cela permet d’inactiver le complément qui pourrait détruire les cellules en culture dans le cas où le SVF contiendrait des anticorps pouvant reconnaitre les cellules cultivées.
Tampon PBS (Phosphate buffered saline)
Le tampon PBS provient de Sigma Aldrich. Sa fiche technique est la suivante:
- NaCl 137mM
- KCl 2,7mM
- Na2HPO4 10mM
- KH2PO4 1,4mM
- D-glucose 1,0g/L
Solution de digestion (Trypsine-EDTA)
Pour le détachement des cellules, le milieu suivant a été utilisé: Trypsine- EDTA (0,25%), rouge de phénol (Gibco, BRL, France)
Support de cellules en culture
Les cellules sont cultivées dans des flacons de culture cellulaire 75cm2 (Dutscher, France) et
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V.1.1 Mises en culture des cellules
Culture primaire:
Une ampoule de chaque cellules BXPC3, MCF7 et HUVEC est mise à décongeler au bain marie pendant 30 min à 37°C.
Après la décongélation, chaque ampoule contant les cellules est transférée dans un Falcon afin d'éliminer l'agent protecteur le DMSO (Diméthylsulfoxyde) par centrifugation. Un lavage est ensuite réalisé en milieu de culture afin d'éliminer toutes traces de DMSO. Un culot cellulaire est obtenu à la fin de cette étape.
Du milieu de culture adapté et frais est ajouté dans chaque Falcon. Enfin, le milieu de culture contenant les cellules en suspension est transféré dans une boite de culture 75cm2.
Les boites de culture sont ensuite placées dans un incubateur à 37°C (5% de CO2 et 95% d'air frais).
L'examen au microscope inversé à contraste de phase renseigne sur l'adhésion des cellules au fond de la boîte.
D'une façon générale, les cellules arrivent à confluence au bout de 4-5 jours.
Le milieu de culture est changé tous les deux-trois jours afin de conserver l'action des antibiotiques et de renouveler l'apport en facteurs de croissance et en nutriments.
Passage en subculture ou en culture sur microplaque :
Détachement des cellules
A confluence, les cellules sont lavées une fois avec 5 mL de tampon PBS. Le détachement des cellules se fait en laissant agir 2-3 mL de la trypsine-EDTA pendant 3 min à 37°C.
La digestion est arrêtée par ajout de 5 mL de PBS. La suspension cellulaire est transférée dans un falcon et centrifugée à 400g pendant 10 min. Les cellules sont ensuite remises en suspension soit en RPMI (pour les BXPC3 ou MCF7) soit en DMEM (pour les HUVEC). La numération et l'estimation de la viabilité cellulaire sont alors réalisées.
139 Contrôle de la viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire est évaluée par le test d'exclusion en bleu trypan. Les cellules sont diluées en bleu trypan puis comptées sur une cellule de Malassez.
Les cellules sont utilisables si la viabilité cellulaire est supérieure à 98%.
% de viabilité= Nb total de cellules claires non bleues / (Nb total de cellules claires + Nb total de cellules) X 100
Comptage cellulaire
La suspension cellulaire est diluée en bleu trypan. Les cellules sont comptées à l'aide d’une microscopique optique.
La concentration cellulaire C qui exprime le nombre de cellules/mL est calculée par la formule suivante:
C = ((N1+N2....+N)/n-1)*l'inverse de la dilution*104
Culture sur microplaque
Une fois le comptage réalisé, la suspension cellulaire est diluée en milieu de culture afin d'obtenir une concentration à 50 000 cellules/mL.
100μL de cette suspension est déposée dans les 96 puits de la microplaque afin d'obtenir une concentration finale de 50 cellules/μL.
Les microplaques sont placées dans l'incubateur à 37°C (5% de CO2 et 95% d'air frais) pendant 24h ou 48h suivant le type d'expérience réalisé.
Subculture
Le reste de suspension cellulaire est mis dans des flacons de culture et mis dans l'incubateur à 37°C afin que les cellules puissent adhérer de nouveau et ainsi de réaliser de nouvelles expériences.
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V.1.2 Purification des MPs à partir des milieux
conditionnés
La purification des MPs a été faite d’après les recommandations de La Croix et al [1] à partir des milieux conditionnés (milieux issus de la culture des cellules). Ces milieux contiennent tous les facteurs libérés par les cellules pendant un temps de culture déterminé mais sont appauvris en certaines substances utilisées par les cellules pendant la culture comme le glucose ou certains facteurs de croissance. Cette technique nous a permis de récupérer les différents facteurs libérés par les cellules tumorales exposées ou non à un traitement.
Méthode de préparation
Les microparticules provenant de cellules sont produites à partir du surnageant de culture des lignées de BXCP3, MCF7 et d’HUVEC.
1) Les cellules tumorales sont détachées de leur support de culture par trypsinisation classique.
2) Après numération, les cellules sont ensemencées après dilution en RPMI afin d'obtenir une concentration à 50 000 cellules/mL, 100μL de cette suspension est déposée dans les 96 puits de la microplaque afin d'obtenir une concentration finale de 50 cellules/μL.
3) En parallèle, des boites ne contenant pas de cellules cancereuses mais des HUVEC sont également préparées et traitées dans les mêmes conditions afin d’obtenir les contrôles.
4) Les microplaques sont placées dans l'incubateur à 37°C (5% de CO2 et 95% d'air frais) pendant 24h ou 48h.
6) Après 48 heures ou 72 heures de culture, les milieux de culture des differents puits sont transférés dans des tubes coniques stériles et centrifugés à 1200 g pendant 15 minutes à + 4°C afin d’éliminer d’éventuels débris cellulaires, le surnageant est prélevé jusqu’à 1cm du fond du tube puis remis en suspension. Ce surnageant est ensuite centrifugé 20 min à 10 000g de façon à concentrer les MPs dans un culot.
7) Le culot est resuspendu deux fois par 1mL de PBS afin de laver les microparticules avant une nouvelle centrifugation pour reformer le culot et écarter le surnageant.
8) Le culot final est repris par 1mL de PBS ou par 1ml de milieu de culture suivant son utilisation et est utilisé frais.
141 Il est préférable de ne pas conserver les échantillons centrifugés plus de 4 heures à température ambiante. L’analyse des microparticules se fera préférentiellementsur échantillons frais; il est cependant possible de conserver les culots pendant 6 mois et à -80°C. L’analyse pourra alors se faire après décongélation.
Le protocole présenté répond aux critères internationaux de préparation des microparticules approuvées par le comité international de standardisation scientifique ISTH [2].
Coculture cellules cancereuses et microparticules
La coculture des cellules cancéreuses et des microparticules a été réalisée de la façon suivante :
1) Culture des cellules cancéreuses en RPMI (12ml) 2) Récuperation du surnageant total
3) Préparation du culot de MPs (comme ci-dessus)
4) Reprise du culot par le RPMI (volume identique au protocole initiale : 12ml) 5) Culture des cellules cancereuses en présence du RPMI+MPs