Cytométrie en flux

 Principe de la cytométrie

La cytométrie en flux est une méthode d’analyse de cellules en suspension, véhiculées à grande vitesse jusqu’à une chambre d’analyse traversée par des faisceaux lasers. L’interaction des cellules avec la lumière permet de caractériser et classifier les cellules selon différents critères tels que la taille, la forme, la complexité́ ou la présence d’une molécule révélée par un composé fluorescent. L’utilisation de molécules fluorescentes (fluorochromes) couplées à des anticorps, protéines ou molécules permettent la détection spécifique des composants cellulaires ou leur intégration. Les marqueurs fluorescents absorbent l’énergie lumineuse à une longueur d’onde donnée et émettent à une longueur d’onde plus élevée (émission > excitation). L’émission de fluorescence est canalisée et véhiculée par fibre optique jusqu’à une série de détecteurs (photomultiplicateurs) placés en aval de filtres (sélection chromatique).

149 - Le système fluidique constitué d'une veine liquide s'écoulant à vitesse constante

qui entraîne et focalise un deuxième flux liquide contenant l'échantillon. Ce système permet le centrage hydrodynamique des éléments.

- Le système optique composé d’un laser (source optique d’excitation des fluorochromes) et de lentilles pour focaliser le faisceau laser.

Le système optique de réception est constitué d’une lentille pour collecter la lumière émise, de miroirs et de filtres optiques pour diriger les longueurs d’onde spécifiques sur les photomultiplicateurs. Ces derniers permettent deconvertir l’énergie lumineuse en énergie électrique.

- Le système électronique convertit les signaux électriques en

signauxnumériques, coordonne les données, prépare les représentations graphiques et lesanalyses statistiques [11-14].

- L’ordinateur analyse les données statistiques et représente sous forme d’histogramme ou de « dot plots » (nuages de points) la population cellulaire dont les propriétés sont évaluées. Toutes les expériences sont réalisées à l’aide du cytomètre FACScan avec un laser de longueur d’onde de 488 nm (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) et la fluorescence émise par stimulation du fluorochrome marqueur est analysée par une cellule photoélectrique. Des filtres lumineux et dichroïques permettent l’analyse simultanée de 3 couleurs, en plus

de la lumière blanche : FL-1, FL-2, FL-3 (Tableau V- 1). Les données sont

traitées et analysées à l’aide du logiciel CellQuest ou ModFit pour le cycle cellulaire (Becton Dickinson, USA).

150

Figure V- 6 : Représentation schématique d'un cytomètre de flux (d’après Brown S. 2001)

Le cytomètre en flux comprend trois parties : (1) un réseau fluidique constitué d'une veine liquide s'écoulant à vitesse constante qui entraîne et focalise un deuxième flux liquide contenant l'échantillon (ici suspension cellulaire) ; (2) un banc optique avec une ou plusieurs sources lumineuses, des détecteurs du type photodiode (pour la diffusion de la lumière), des photomultiplicateurs et filtres optiques qui permettent de quantifier les diverses fluorescences émises par chaque objet ; (3) un microprocesseur qui convertit les signaux électriques en signaux numériques, coordonne les données, prépare les représentations graphiques et les analyses statistiques. Certains appareils comprennent un dispositif de tri. En polarisant brièvement le jet, on obtient des gouttelettes chargées (+ ou -) qui seront déviées, avec leurs contenus, dans un champ électromagnétique. Les analyses se font à plusieurs milliers d'objets par seconde

Tableau V- 1 : Laser et filtres du cytomètre en flux Becton Dickinson

Laser Paramètres Filtres (nm) Exemple de Fluorochrome

488nm FL-1 FL-2 FL-3 515/30 582/42 650 FITC IP, PE F.Rouge, IP

151  Application de la cytométrie de flux

Dans notre étude, la cytométrie de flux a été utilisé pour l’étude des cellules cancéreuses mais également pour l’étude des microparticules relarguées dans le milieu par ces mêmes cellules cancereuses.

- Les récepteurs exprimés à la surface des cellules ou des MVs sont reconnus spécifiquement par un anticorps dirigé spécifiquement contre l’antigène désiré et marqué par un fluorophore. Les cellules ou les microparticules peuvent par exemple exprimer l’annexine V qui se lie spécifiquement aux phospholipides chargés négativement comme la PS, ou exprimer du facteur tissulaire détectable par l'utilisation d'un anticorps anti-FT.

- La cytométrie en flux est la méthode de choix pour l’étude des microparticules. Il s’agit cependant d’une technique délicate car, les MPs mesurant entre 0,1 et 1μm, il faut se placer dans des zones proches de la limite de sensibilité des cytomètres en ce qui concerne la détection de la taille. La zone de taille des MP est définie en utilisant un mélange de billes fluorescentes de diamètres différents. La cytométrie en flux permet de déterminer le nombre d’évènements (forward scatter) ainsi que la densité des évènements (side scatter).

 Marquage des cellules à l'annexine V ou au facteur tissulaire

Il est indispensable de vérifier la propreté du cytomètre afin d’éliminer les impuretés qui pourraient être numérées comme des MP. Avant chaque série, un tube contenant environ 0,5 mL d’eau stérile est analysé au cytomètre afin de réaliser un « blanc échantillon ». Pour commencer la série, le nombre d’évènements au bout d’une minute, doit être inférieur à 5 par seconde. Si ce n’est pas le cas au bout de trois fois, une procédure de nettoyage du cytomètre à l’éthanol dilué à 50% doit être lancé. Cette première étape est très importante et doit être respectée.

152

 Marquage à l'annexine V

Les récepteurs exprimés à la surface des cellules ou des MPs sont reconnus spécifiquement par un anticorps dirigé spécifiquement contre l’antigène désiré et marqué par un fluorophore. Le contrôle négatif est un contrôle isotypique: les cellules sont incubées avec un anticorps monoclonal du même isotype que l’anticorps spécifique et également couplé avec le même fluorochrome (Annexine V-FITC réf 556419, BD technologies).

- Marquage des cellules cancéreuses:

1) Les cellules cultivées en flasque de culture 75 cm2 sont détachées de leur support par trypsinisation classique, apres centrifugation le culot est repris et puis en suspension dans 4 mL de tampon de liaison annexine-V (BD Pharmingen®, Becton Dickinson, France) préalablement dilué au 1/4 en NaCl.

2) Un comptage est réalisé afin d'obtenir une solution à 10⁶ cellules/ml.

3) 500 μL de suspension est transférée dans un tube de 5 mL

4) 5 μL d'annexine V-FITC (Biolegend, San Diego, USA) est ajouté puis vortexé doucement Le mélange est incubé 30 minutes à température ambiante dans le noir.

5) Un centrifugation est réalisée et le culot est repris par 500 μL de tampon de liaison annexine-V dilué.

5) En paralléle un tube contrôle est réalisé en ajoutant 300 μL de suspension cellulaire avec 5μL tampon de liaison annexine-V dilué.

6) Analyse des tubes par cytométrie en flux.

- Marquage des MPs

1) Les culots de MPs sont repris par 100μL de tampon annexine-V dilué (BD

Pharmingen®, Becton Dickinson, France).

153

Réactif ^{Tube 1}

(Isotype)

Tube 2 (AnV)

Binding buffer dilué 20 μL

Annexine V-FITC dilué au

1/2 en Binding buffer dilué ^{20 μL}

Surnageant de MPs 30 μL 30 μL

Incubation à l'abri de la

lumière ^{30 min 30 min}

Binding Buffer dilué 500 μL 500 μL

3) Une centrifugation est réalisée et le culot repris par 500 μL de Binding Buffer dilué.

 Immunomarquage du facteur tissulaire

Le protocole utilisé est le même que pour l’annexine V suivant le protocole ci-dessous:

Réactif ^{Tube 1}

(Isotype)

Tube 2 (FT)

IgG1-FITC 20 μL

mab mouse anti human FT 20 μL

Surnageant de MPs 30 μL 30 μL

Incubation à l'abri de la

lumière ^{30 min 30 min}

Alexa Fluo 20 μL

Incubation à l'abri de la

lumière ^{30 min 30 min}

PBS 500 μL 500 μL

Une centrifugation est réalisée et le culot repris par 500 μL de PBS. Les échantillons sont analysés.

154 Les produits utilisés sont:

- l'anticorps Mab Anti Human TF (réf 4503) : Sekisui Diagnostics - l'Alexa Fluor (réf A11059) : Life technologies

- IgG1-FITC (réf 400107) : Biolegend

 Dénombrement des microparticules par cytometrie enflux

Cette technique par cytométrie en flux permet une numération des MPs basée sur leur taille et les antigénes que les MP expriment à leur surface. De plus, elle présente l’avantage de pouvoir être faite sur des échantillons congelés. En effet, aucun impact majeur de la congélation à -80°C sur la numération des MP n’a été retrouvé dans différentes études. La numération des MPs reste constante après un an de congélation à -80°C (80), et la décongélation des échantillons au bain marie à 37°C avant analyse permet de limiter la génération in vitro des MP [1;15]. Le protocole de dénombrement des microparticules par cytométrie en flux a été décrit en 2007 par Robert et al [16], ce qui a permis de l’adapter à notre laboratoire.

 Calibrage des microparticules

La première étape pour la détection des microparticules consiste às électionner les éléments ayant une taille inférieure à 1 µm (0,8 à 1,5 µm en fonction des études). Ceci est possible grâce à l’utilisation de billes fluorescentes de diamètres variés (0,5µm, 0,9µm et 3µm) couvrant la zone de taille des microparticules.Ce réactif est le Mégamix® (Biocytex).

Ces billes permettent de définir de façon standardisée la zone d'analyse des microparticules. Elles assurent également la stabilité des réglages et permettent de compter les microparticules de façon reproductible. Les billes de 0,9 µm placent la limite haute de détection des microparticules, alors que les billes de 0,5 µm placent la limite basse en dessous de laquelle la différence avec le bruit de fond n’est plus détectable. De plus, il existe désormais le Mégamix Plus® qui permet d’abaisser le seuil de détection à 0,3 µm. Pour notre part nous avons utilisé ces billes Mégamix plus (réf 7803) de Biocytex.

155  Réglage de la zone d’analyse des MPs

Le réglage de la zone d’analyse des MP sur le cytomètre s’effectue à l’aide d’un mélange de 2 catégories de billes fluorescentes de diamètres variés couvrant la zone de taille des MP (billes de 0,5 et 0,9 μm). Ce mélange est également calibré en termes de

concentration car il contient deux billes de 0,5 μm pour une bille de 0,9 μm.

Avant chaque série:

- On vérifie, en position FL1=1 sur le graphe FL1 Log x SS Log, que les billes soient correctement positionnées dans les zones pré-établies. Si ce n’est pas le le cas, on règle le PMT FL1 et/ou SS afin d’y parvenir.

- On vérifie, en position FS1=1 sur l’histogramme FS LOG x Count, que le pourcentage de billes de 0,5 μm est compris entre 48 et 52%. Dans le cas contraire, on modifie le PMT FS comme précédemment. L’ensemble des billes de 0,5 μm permet de définir la limite inférieure de la fenêtre d’analyse des MP. - Enfin, sur le graphe SS Log x FS Log, on vérifie que l’autogate MP (fin du

nuage de billes de 0,9 μm) est toujours correctement positionnée. La limite supérieure de la fenêtre d’étude des MP est délimitée par la fin du nuage de 0,9 μm et doit venir tangenter cette autogate

 Marquage des MPs

Les MPs sont décongelés au bain marie à 37°C puis sont marqués comme indiqué dans le paragraphe précedent.

Les échantillons sont incubés pendant 30 minutes à l’obscurité et à température ambiante. Puis, 500 μL de tampon et 30 μL de billes fluorescentes de comptage Flow-Count (Beckman Coulter) sont ajoutés et chaque tube est vortexé plusieurs secondes. Dans la demi-heure suivant le marquage, l’échantillon est analysé sur le cytomètre. L’acquisition est réalisée à vitesse lente (mode LOW) pendant une minute. L’acquisition est arrêtée au bout d’une minute. La concentration des billes dans le flacon est connue (ex: C=1003 billes/mL) et le nombre d’évènements MP est dénombré par l’appareil. La concentration des MPs est donc déduite par la formule: [MP] = (nombre d’évènements MP x 1003) / nombre de billes. Le principe est le

156 même pour les autres catégories de MP ainsi que pour les MP coexprimant plusieurs antigènes.