Quantification des signaux

La structure des HS est liée à ses différentes modifications des GlcA et GlcNAc qui les composent. A partir des intensités relatives (intensité d'un pic par rapport à un autre pic) des différents oses modifiés, il est alors possible d’en déterminer son taux de modification et son profil disaccharidique.

a) La N-sulfatation

Différentes méthodes peuvent être utilisées pour déterminer le taux de N-sulfatation des HS de l'échantillon. Une première technique serait d'intégrer toutes les intensités des différentes corrélations des GlcNS : GlcNS-GlcA, GlcNS-IdoA et GlcNS-IdoA,2S et des GlcNAc de la région des noyaux anomériques et d'en faire le rapport _{𝐺𝑙𝑐𝑁𝐴𝑐+𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆}𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆 × 100. Toutefois, du fait de l'éclatement des pics, cela augmente l'incertitude sur l'intensité. D'autre part, le pic 1_H

1- 13_C

1 des glucosamines de l'enchainement GlcNS,6S-IdoA,2S (Yates et al. 1996) est confondu avec celui des GlcNAc ce qui conduirait à sous-estimer le taux de sulfatation.

C'est pour cela que le taux de N-sulfatation est déterminé à partir des corrélations 1_H 2- 13_C

2 (Figure 92). Ces corrélations des glucosamines permettent de limiter le nombre de pics à intégrer et donc de réduire l'imprécision de la mesure. De plus, toutes les formes des GlcNAc

142 et des GlcNS indépendamment de l'ose adjacent ont un même déplacement chimique ce qui permet d'augmenter le signal au niveau de ces pics, et donc de réduire l'importance du bruit dans la mesure.

Des intégrations sur plusieurs cultures indépendantes (n=3) de cellules HeLa ont été réalisées. Le taux de N-sulfatation calculé est de 46±2,6%. Ce taux de sulfatation est approximativement le même entre les différentes cultures, ce qui montre également la reproductibilité du protocole utilisé ainsi que la faible variation de ce phénotype au cours des différentes cultures (Figure 93).

b) L’épimérisation des acides glucuroniques

Le taux d'épimérisation des HS est déterminé par l'intégration de tous les pics des acides iduroniques sur l'ensemble des acides uroniques (GlcA+IdoA notés HexA pour acide hexuronique) _{𝐼𝑑𝑜𝐴2𝑆+𝐼𝑑𝑜𝐴(−𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆)+𝐼𝑑𝑜𝐴(−𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆,6𝑆)+𝐺𝑙𝑐𝐴(−𝐺𝑙𝑐𝑁𝐴𝑐)+𝐺𝑙𝑐𝐴(−𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆)}𝐼𝑑𝑜𝐴2𝑆+𝐼𝑑𝑜𝐴(−𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆)+𝐼𝑑𝑜𝐴(−𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆,6𝑆) × 100 dans la

Figure 92 : Spectre RMN 13_{C-HSQC des déplacements chimiques H}

2-C2 des glucosamines d'HS. Les encadrés verts

représentent les bornes utilisées pour l'intégration des pics. L’échantillon est analysé à 37°C pendant 16h dans un spectromètre 600MHz équipé d’une cryosonde.

Figure 93 : Caractéristiques des HS de cellules HeLa. Tableau de valeurs (A) et graphique des

143 zone de corrélation des noyaux anomériques. Pour les 3 cultures cellulaires HeLa, le taux de C5-épimérisation mesuré est de 28,7±2,1%. Comme pour la N-sulfatation, la quantité en acides iduroniques semble stable selon les différentes cultures (Figure 93A).

c) La 2-O-sulfatation des acides iduroniques

La 2-O-sulfatation est déterminée à partir du signal des IdoA,2S comparé aux autres acides iduroniques ou uroniques 𝐼𝑑𝑜𝐴2𝑆_{∑ 𝐼𝑑𝑜𝐴} × 100 ou 𝐼𝑑𝑜𝐴2𝑆_{∑ 𝐻𝑒𝑥𝐴}× 100 dans la zone des noyaux anomériques (Figure 94). Au sein d'une chaine d'HS, en moyenne 18,7±3,8% des acides uroniques sont 2-O-sulfatés, et sont très majoritairement portés par les IdoA. Les IdoA,2S représentent 64,8±8,6% de tous les IdoA (Figure 93).

d) La 6-O-sulfatation des glucosamines

Le taux de 6-O-sulfatation est déterminé par l'intégration des pics des corrélations 1_H 6- 13_C

6 des glucosamines 6S et 6OH 𝐺𝑙𝑐𝑁,6𝑆

𝐺𝑙𝑐𝑁,6𝑆+𝐺𝑙𝑐𝑁,6𝑂𝐻× 100 (Figure 95). La pureté de l'échantillon est importante afin de pouvoir déterminer précisément le taux moyen de 6-O-sulfatation car des corrélations issues des contaminants peuvent parasiter cette région du spectre et rendre

Figure 94 : Spectre RMN 13_{C-HSQC des déplacements chimiques H}

1-C1 des acides uroniques d'HS. Les encadrés

verts représentent les bornes utilisées pour l'intégration des pics. L’échantillon est analysé à 37°C pendant 16h dans un spectromètre 600MHz équipé d’une cryosonde.

Figure 95 : Spectre RMN 13_{C-HSQC des déplacements chimiques H}

6-C6 des glucosamines d'HS. Les encadrés verts

représentent les bornes utilisées pour l'intégration des pics. L’échantillon est analysé à 37°C pendant 16h dans un spectromètre 600MHz équipé d’une cryosonde.

144 impossible l'analyse quantitative. Les chaines d'HS issues de cellules HeLa présentent un taux de 6-O-sulfatation moyen de 23±4,7% (n=3) (Figure 93).

e) La longueur des chaînes

Une estimation de la longueur des chaînes peut être obtenue en utilisant une des corrélations 1_H

5-13C5 de l'unité xylose du tétrasaccharide linker comme référence interne. En effet, le mode de digestion et de purification des chaînes d'HS que nous avons utilisé doit conserver le tétrasaccharide linker dans la chaîne. Donc, chaque chaîne d'HS, en dehors de toute dégradation fortuite, est censée contenir une unité xylosique. L'une des corrélations 1_H

5- 13_C

5 présente des déplacements chimiques à (3,4 ppm 1H - 65,7 ppm 13C) dans une zone résolue du spectre (Figure 96). La comparaison des intensités de cette corrélation – comptant pour un proton – avec celle des signaux 1_H

2-13C2 des glucosamines comptant pour autant de protons que d'unités disaccharidiques permet alors de pouvoir estimer la longueur des chaînes selon la formule suivante : 𝑋𝑦𝑙

𝐺𝑙𝑐𝑁𝑆+𝐺𝑙𝑐𝑁𝐴𝑐 . Ceci ne peut toutefois donner qu'une estimation grossière de la longueur de chaîne dans la mesure où l'on compare un signal a priori faible par rapport à un autre grand. De fait, dans le cas des cellules HeLa analysées ici, les signaux 1_H

5-13C5 des xyloses (3,4-65,7ppm) sont peu intenses, proches du bruit de fond. L'estimation que nous pouvons faire ici est très imprécise, de l'ordre de 70 à 100 disaccharides, ce qui correspondrait à des masses moléculaires de 25 à 40 kDa en prenant en compte la contribution des chaînes de CS dans ce calcul comportant également une unité de xylose par chaine (quantité en CS déterminée à moins de 15% par RMN).

f) 2-O-sulfatation des GlcA, 3-O-sulfatation des GlcN et glucosamines non-substituées

Les acides glucuroniques 2-O-sulfatés présentent un signal caractéristique pour les corrélations H2-C2 à 4,14ppm-83,1ppm (Guerrini et al. 2005). De même, les glucosamines 3-O- sulfatées présentent un signal caractéristique de la 3-O-sulfatation à 5,19ppm-100ppm pour les H1-C1 de 5,19ppm-100ppm (Guerrini et al. 2005). Ces signaux ne sont pas observés dans

Figure 96 : Spectre RMN 13_{C-HSQC des déplacements chimiques H}

2-C2 des glucosamines et d'une paire H5-C5 du

xylose d'HS. Les encadrés verts représentent les bornes utilisées pour l'intégration des pics. L’échantillon est

145 les spectres des HS issus de cellules HeLa ce qui suggère que ces sulfatations sont rares dans ce matériel. De même, les corrélations des glucosamines non-substituées (GlcNH3+) dont les corrélations H1-C1 sont attendues à 5,43ppm-57ppm ne sont pas observées.

g) Analyse des unités disaccharidiques

De cette analyse, on peut maintenant estimer le nombre moyen de sulfate par disaccharide. Ce nombre est de 0,88 et est la somme de la N-sulfatation, de la 2-O-sulfatation et de la 6-O-sulfatation. D'autre part, il est également possible d’après ces spectres d'obtenir des informations sur les enchaînements disaccharidiques des HS. Les GlcNS sont majoritairement suivies d'un IdoA±2S au moins à 70%. Cette mesure est probablement par défaut, car, comme précisé précédemment, la mesure de la quantité de GlcNS,6S-IdoA,2S n'est pas possible. Les 30% restants (GlcNS-GlcA) correspondraient aux domaines de transition NA-

NS. Si l'on estime maintenant à partir de l'intensité des corrélations des GlcA, le pourcentage

de glucosamines liées N-sulfatées, on obtient de l'ordre de 20%. Cette différence de valeur peut provenir de l'intégration du pic GlcA-GlcNS dans la zone des noyaux anomériques. En effet, les pics des GlcA-GlcNS et GlcA-GlcNAc étant mal résolus, le choix des limites d’intégration reste arbitraire.

Les GlcNS sont en revanche suivies de manière égale par les IdoA (≈35%) et IdoA,2S (≈35%). Toutefois, les IdoA sont majoritairement suivis de GlcNS,6S (80%) comparées aux GlcNS (20%) (Figure 97).

Ces résultats sont en accord avec les données existantes sur les HS de Gallagher et al. 1985 estimant la N-sulfatation des HS de mammifères de différents tissus entre 40 et 50 %. Pour les cellules HeLa, nous avons quantifié le nombre de N-sulfates à 46 % en moyenne, là aussi en accord avec Takegawa et al. 2011 pour ce type cellulaire. Le ratio N-/O-sulfates est généralement supérieur à 1 (Gallagher & Walker 1985), et pour les cellules HeLa ici étudiées ce ratio est de 1,1.

Ainsi nous avons montré que les chaines d’HS extraites des protéoglycanes et des surfaces cellulaires pouvaient être purifiées et analysées par des techniques de RMN liquide. En effet, les signaux obtenus présentent une sensibilité et une résolution suffisante pour

Figure 97 : Caractéristiques des unités disaccharidiques des HS de cellules HeLa. Proportion des disaccharides

des HS de cellules HeLa dans lesquels une GlcNS±6S est associée à X = GlcA (bleu), IdoA (jaune) ou IdoA,2S (vert) ; un IdoA est associé à Y = GlcNS (bleu) ou GlcNS,6S (jaune) ; un GlcA est lié à Z = GlcNAc (bleu) ou GlcNS (jaune).

146 détecter et discriminer une grande quantité d’unités disaccharidiques diversement modifiées. Toutefois, les modifications rares telles que les 2-O-sulfatations des GlcA et les 3-O- sulfatations ou non-substitutions des GlcN ne sont pas présentes dans ces HS en quantité suffisante pour être observables. La sensibilité de l’expérience permet cependant d’estimer la longueur moyenne des chaines d’HS des cellules HeLa présentes à leur surface grâce à la détection d’une corrélation du xylose qui n’est pourtant présente qu’en un seul exemplaire par chaîne.

C. Etudes de polysaccharides d’HS issus de deux types cellulaires : application