C. Etudes de polysaccharides d’HS issus de deux types cellulaires : application du
1. Les fibroblastes de souris embryonnaires (MEF)
Les MEF, et plus généralement les fibroblastes, sont les cellules productrices majeures de la matrice extracellulaire en sécrétant en abondance notamment les PG et les collagènes. Ces fibroblastes sont donc d'une grande importance pour l'organisme formé ou en cours de formation en étant responsables de l’établissement de structures solides et solubles pour les différentes cellules et leur développement.
Ici, je vais comparer les HS issus de la lignée sauvage aux HS issus de la lignée MEF KO pour le gène codant une enzyme clé de la biosynthèse des HS : la NDST-1 (cellules notées ndst-
1-/-). L'enzyme est responsable de la N-désacétylation/N-sulfatation des GlcNAc en GlcNS et forme les substrats préférentiels pour les enzymes plus en aval dans la voie de biosynthèse des HS. Nous avons donc voulu caractériser l'impact de la suppression de la NDST-1 sur la biosynthèse des HS et les différences structurales des chaines issues de ces cellules.
a) Détermination par cytométrie en flux de la présence d’HS au niveau des surfaces cellulaires
Les cellules sauvages (MEF WT) incubées avec l’anticorps dirigé contre les HS montrent une intensité de fluorescence importante (médiane de 100, courbe rouge) comparée au contrôle isotypique (médiane de 4, courbe bleue) ce qui indique la présence d'HS en quantité
147 importante comme pour cellules HeLa (Figure 98A). La présence d'HS au niveau des surfaces cellulaires de MEF ndst-1-/- est également observée et nous pouvons constater une diminution dans l'intensité de fluorescence (médiane à 60) (Figure 98B). Ce résultat ne signifie pourtant pas que la cellule ndst-1-/- produit moins de chaines d’HS mais plutôt qu'il y a effectivement un changement de structure au niveau des HS lorsque les cellules n'expriment plus la NDST-1.
Des techniques plus qualitatives doivent être mises en place pour caractériser ces changements.
Les cellules WT et KO marquées aux anticorps dirigés contre les CS (courbes vertes Figure 98) montrent une intensité de fluorescence légèrement supérieure à celle du contrôle isotypique. Cela suggère une présence des CS à la surfaces de ces deux variants cellulaires (WT et KO) dans des quantités très faibles par rapport aux HS. Notons néanmoins que nous avions observé des intensités de fluorescence similaires chez les cellules HeLa pour une présence de CS de l'ordre de 10 % d’après l'analyse des résultats de RMN. Cela suggère que l'absence de la NDST-1 ne joue pas de rôle au niveau de l'expression des chaînes des CS.
Ainsi, les résultats obtenus par cytométrie en flux montrent la présence d'HS en quantité moindre sur les surfaces des MEF WT et KO par rapport aux cellules HeLa. Toutefois, Les MEF, par la présence encore importante en HS, constituent un bon modèle d'étude, et la caractérisation des chaînes d'HS peut être menée pour évaluer l'impact de l'absence de la NDST-1 sur la structure finale de la chaîne d'HS.
b) Marquage et purification
Les cellules MEF sont cultivées en milieu marqué contenant le 13C-glucose comme pour les cellules HeLa. Les HS sont issus de 200 millions de cellules après digestion à la trypsine à 37°C.
Figure 98 : Analyse par cytométrie en flux des cellules MEF WT (A) et ndst-1-/- (B). Des anticorps spécifiques sont
utilisés pour détecter les GAG à la surface des cellules. Détection des HS (rouge) et CS (vert), contrôle isotypique (bleu).
148 Les deux lots d'HS issus des cellules MEF WT et MEF ndst-1-/- sont ensuite purifiés par chromatographie échangeuse d'anions, digérés à la DNase I et purifiés une nouvelle fois par chromatographie en gradient de sel. Comme pour la purification des HS extraits des cellules HeLa, seules les fractions éluées en forte concentration saline contenant les HS sont gardées, préparées et analysées. Dans le cas des extraits issus des MEF ndst-1-/-, les chromatographes ne présentaient pas de pics d'élution suffisamment résolus et toutes les fractions absorbant aux différentes longueurs d'onde ont été récupérées. Les différents chromatographes obtenus à l'issue de ces digestions sont présentés en annexe 2 et 3.
c) Analyse RMN de l’évolution du profil saccharidique
Dans la Figure 99 sont représentés les spectres 13C-HSQC des fractions d'HS issus des cellules MEF sauvages et des cellules MEF ndst-1-/-. Les spectres sont globalement équivalents sur le plan de la qualité spectrale. En particulier, ils ne présentent pas de contamination notable par des acides nucléiques et permettent tous les deux une analyse quantitative d'un certain nombre de caractéristiques structurales des HS. Un premier examen montre pour les cellules MEF ndst-1-/- la diminution de certains des pics associés aux espèces sulfatées.
Figure 99 : Spectres RMN 13C-HSQC d'HS cellulaires purifiés à partir de cellules MEF WT (noir) et ndst-1-/-
(rouge). Les échantillons sont analysés à 37°C pendant 16h dans un spectromètre 600MHz (spectre rouge)
149 L'intégration des pics d'intérêt pour l'analyse quantitative est faite au niveau des mêmes pics utilisés pour la détermination des caractéristiques structurales des HS issus des cellules HeLa.
La quantification par RMN révèle effectivement une baisse de la N-sulfatation générale des HS de MEF KO (34%) comparés à ceux des MEF WT (51%). Une baisse de l'épimérisation est également observée, passant de 36% pour les MEF WT à 14% pour les MEF KO. Cette réduction du taux d'épimérisation est effectivement en accord avec le mécanisme catalytique admis pour la C5-épimérase où le substrat est un enchaînement GlcNS-GlcA ; la réduction de la quantité de substrat entrainant une baisse de la quantité en IdoA. En conséquence, la quantité de 2-O-sulfatation (IdoA,2S) est également diminuée dans les HS des MEF KO (9%) par rapport aux MEF WT (24%). Toutefois, l'efficacité de la HS2ST envers les IdoA n'est pas altérée car leur taux de 2-O-sulfatation est le même (≈66% des IdoA sont 2-O-sulfatés). La 6-
O-sulfatation des glucosamines ne varie pas dans les chaines d'HS selon que la cellule exprime
la NDST-1 (20%) ou pas (18%) (Figure 99). Le nombre de sulfate moyen par disaccharide diminue de 0,95 (pour les cellules WT) à 0,61 pour les cellules ndst-1-/-.
L'analyse par RMN de la composition en disaccharide révèle que les MEF KO synthétisent des chaines d'HS possédant une quantité en GlcNS-GlcA plus importante (51%) que les MEF WT (29%). Les glucosamines liées aux IdoA sont également différemment modifiées selon les deux souches cellulaires. Les WT formant principalement des IdoA reliés à des GlcNS (65%) alors que sur les cellules KO à la ndst-1 les IdoA sont surtout reliés à des GlcNS,6S (88%). En revanche, pour les disaccharides contenant un GlcA, quel que soit l'état de la cellule, les GlcA-GlcNAc sont les disaccharides les plus nombreux comparés aux GlcA- GlcNS(±6S) (Figure 101).
Figure 100 : Comparaison des profils de sulfatation et d'épimérisation des HS issus de cellules MEF WT (orange) et ndst-1-/- (vert). Quantification d’après les résultats RMN.
150 L'estimation de la longueur des chaînes entre les différentes cellules d'après le rapport de corrélations H2-C2 des glucosamines et H5-C5 du xylose (Figure 102) montre une longueur similaire d'une trentaine d'unités disaccharidiques pour les deux types cellulaires, ce qui correspond à une masse moléculaire d'une vingtaine de kilodaltons.
Parallèlement à cette étude, une détermination de la structure des HS par digestion puis analyse chromatographique de la composition en disaccharides a été menée par nos collaborateurs du groupe de Lena Kjellén qui nous a fourni les cellules MEF WT et KO. Les résultats obtenus sont en excellent accord avec les nôtres (voir publication Pegeot et al 2014 présentée en annexe 7).
L'utilisation de la RMN comme outil pour mesurer et analyser l'impact de l'absence d'une enzyme de biosynthèse des HS sur la structure même du polysaccharide est validée par la capacité à pouvoir déterminer les différences de taux de modifications des chaînes issues des MEF WT et des MEF ndst-1-/- ainsi que leur structure disaccharidique.
Figure 101 : Comparaison des disaccharides d'HS issus de cellules MEF WT (WT) et ndst-1-/- (KO). Proportion en
disaccharides d'HS de cellules MEF WT et ndst-1-/- dans lesquels une GlcNS(±6S) est associée à X = GlcA (bleu),
IdoA (jaune) ou IdoA,2S (vert) ; un IdoA à Y = GlcNS (bleu) ou GlcNS,6S (jaune) ; un GlcA est lié à Z = GlcNAc (bleu) ou GlcNS (jaune).
Figure 102 : Spectre RMN 13C-HSQC des déplacements chimiques H
2-C2 des glucosamines et d'une paire H5-C5
du xylose d'HS de cellules MEF WT (gauche) et ndst-1-/- (droite). Les encadrés verts représentent les bornes
151 Le protocole ainsi établi sur la base des cellules HeLa, et validé pour les cellules MEF, a été transposé aux cellules épithéliales Caco-2 pour l'étude de l'évolution du profil disaccharidique de ces cellules au cours d'un phénomène de différenciation.