D. Etude des HS dans le contexte du protéoglycane
1. Etudes des sucres à partir de cellules entières
Les cellules HeLa analysées ont été cultivées comme précédemment dans un milieu marqué (13C-glucose) et ont été récupérées après détachement du support par une solution d’EDTA (versène) afin de préserver les molécules présentes sur les surfaces cellulaires. Les
157 cellules sont, après lavage, directement introduites dans un rotor pour leur analyse par RMN solide par centrifugation.
Dans la Figure 108 sont présentés les résultats d’expériences préliminaires faites avant le début de ce travail. Le spectre 13C 1D en démarrant par une excitation directe du 13C et obtenu sur des cellules HeLa entières est présenté en bleu dans cette Figure 108. Dans ce spectre montrant toutes les résonances carbones détectables, on peut immédiatement observer la présence de signaux résolus nettement au-dessus du bruit de fond. De plus, une partie de ces signaux correspond aux fréquences où sont attendus les signaux des espèces glycosidiques (entre 50ppm et 100ppm). On observe également des signaux aux fréquences des carbones des fonctions carboxyliques (172 ppm) comme aux carbones des chaînes insaturées (128 ppm). De même, un certain nombre de signaux résolus sont présents vers 20 ppm, région où sont attendus les signaux des groupements N-acétyles des glucosamines non- modifiées. Ces premiers résultats ont suggéré la présence d'un ensemble d'espèces de nature glycosidique.
Des cellules HeLa ont été ensuite traitées aux héparinases I et III. Dans ce cas, on peut noter qu'après digestion des surfaces cellulaires, les intensités de certains pics diminuent, en particulier à 100ppm dans la région des carbones anomériques des sucres, ce qui suggère qu'une partie de ces signaux pourrait être attribuée à des espèces de type HS (spectre rouge).
Enfin, lorsque les cellules sont traitées simultanément aux héparinases, chondroïtinase et N-glycosidase, les signaux à 100ppm sont pratiquement abolis, les signaux vers 80-60ppm sont fortement diminués comme également un pic à 23ppm alors que les autre signaux ne sont pas touchés. Les cellules étant intactes, cela suggère fortement que les espèces à l'origine
Figure 108 : Analyses par RMN solide d'un spectre 13C après excitation directe du carbone. Détection enregistrée
sur des cellules HeLa intactes (bleu), traitées aux héparinases I et III (rouge) et traitées aux héparinases I et III, chondroitinase ABC et N-glycosidase (vert). Les spectres sont enregistrés à 12°C pendant 30 minutes à une vitesse de rotation à l'angle magique (MAS) de 12kHz. Les flèches noires indiquent les signaux affectés par les traitements enzymatiques.
158 de ces signaux sont accessibles aux traitements enzymatiques et donc exposées à la surface de la cellule.
Tous ces résultats tendent à montrer qu'il existe à la surface cellulaire une quantité d'espèces glycosidiques suffisamment importante pour être observable par RMN du solide. De plus, le fait qu'une partie de ces espèces soit sensible à l'action des héparinases suppose une contribution significative des HS au niveau des membranes.
Ces résultats étant alors très encourageants et comme la technique de RMN 1D ne permet pas une caractérisation plus précise de la nature de ces composés, des expériences bidimensionnelles ont été réalisées afin d'améliorer la résolution et de caractériser plus finement les espèces présentes.
De même afin d'obtenir la plus grande sensibilité des analyses, la totalité des 200 millions de cellules HeLa récoltées ont été placées dans un rotor à large volume (7mm de diamètre). Les analyses ont été effectuées à l'Institut Nanoscience et Cryogénie (INAC) sur un spectromètre 400MHz équipé d'une sonde solide (collaboration avec le Dr. Hediger). L'échantillon étant plus conséquent, une meilleure sensibilité est attendue pour ces expériences bidimensionnelles.
Des expériences de corrélation 13C-13C ont été réalisées permettant d'observer des corrélations aux fréquences de carbones vicinaux (Figure 109). Sur la figure est représenté le spectre obtenu. Malgré la quantité de cellules utilisées, la sensibilité du spectre n'est pas optimale. On peut toutefois observer dans la région des carbones anomériques (90-105ppm, encadré vert), plusieurs signaux diagonaux correspondant à autant de carbones anomériques. Chacun de ces carbones est voisin d'un autre carbone dont le déplacement chimique est dans la gamme des 70ppm. De même, des corrélations diagonales et hors diagonales sont observées entre carbone dont les déplacements chimiques sont compris entre 60 et 80 ppm. Cela est en accord avec ce qui est attendu pour les déplacements chimiques des oses. Par contre, nous n'observons pas de corrélation C1-C2 aux déplacements chimiques attendus pour des GlcA (105ppm-76ppm), des GlcNAc (100ppm-56ppm) et GlcNS (100ppm- 60ppm).
Il est ainsi possible d'observer les signaux de sucres pour des cellules eucaryotes HeLa entières par ssNMR. Cette technique est suffisamment résolutive pour déterminer certaines corrélations. Cependant, bien que des HS puissent être présents au niveau des surfaces cellulaires (cf traitement aux héparinases Figure 108), nous n'avons pas pu observer leurs déplacements chimiques par les expériences 2D de corrélation 13C-13C par le couplage scalaire (couplage via les liaisons chimiques). Cela pourrait s'expliquer par une trop faible quantité d'HS pour les analyses dans ces conditions et donc une trop faible sensibilité. Des expériences dites par Cross Polarization (CP) et démarrant de l'aimantation du proton ont été testées. Malgré le gain de sensibilité escompté du fait du rapport gyromagnétique du proton, ces expériences n'ont pas permis d'augmenter l'aimantation détectée. Cette faible efficacité du transfert CP entre le proton et le carbone peut s'expliquer par la présence d'une flexibilité importante au sein de la molécule et qui tend à réduire le couplage dipolaire 1H-13C (résultat non-montré).
159 Dans le but d'augmenter significativement la sensibilité de l'expérience, des techniques de polarisation nucléaire dynamique (DNP) ont été testées sur les cellules HeLa.