Quantification des HS

Afin de caractériser les échantillons purifiés, il est important de déterminer assez précisément la quantité d'HS récoltés à la surface membranaire des cellules HeLa. Toutefois il n'existe pas de méthodes simples et fiables pour l'analyse des HS dans ces conditions complexes. Cependant, il existe différentes techniques utilisées qui ont été testées et qui seront présentées pour un même extrait issu de digestion à la trypsine des surfaces cellulaires et purifié une première fois par chromatographie échangeuse d'anions.

a) Dosage des acides uroniques par la méthode au carbazole

Le dosage au carbazole (Bitter & Muir 1962) repose sur la fixation de ce composé coloré sur un dérivé des acides uroniques (qui composent les HS, CS et HA) créés dans certaines conditions (voir matériel et méthode). L'absorbance à 530nm est donc

135 proportionnelle à la quantité en acide uronique. La réactivité croisée des autres GAG semble limitée car seuls les HS sont observés sur les surfaces cellules par cytométrie en flux (Figure 68).

Une gamme étalon est réalisée par dilution en cascade d'un échantillon d'HS de concentration connue. Les valeurs d'absorbance à 530nm sont données en fonction de la concentration en HS et une droite d'équation de la forme 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 correspondant à cette gamme est tracée (Figure 87). Le coefficient de détermination R² est calculé ; plus sa valeur tend vers 1 et plus la droite est représentative du modèle (ici l'absorbance à 530nm en fonction de la concentration en HS).

L’absorbance de l’échantillon mesurée est de 0,53 ce qui représente une concentration de 100µg/mL d’après la gamme étalon. Sachant que le volume totale est de 400µL, la quantité en HS (et CS potentiels) est de l’ordre de 40µg issus de 200 millions de cellules HeLa. L'analyse a également nécessité 50µL d'échantillon, soit 13% du matériel obtenu (≈5µg).

La concentration en HS de l'extrait a également été estimée par une seconde méthode, commerciale, dans le but de quantifier les HS dans l'extrait et de comparer les deux méthodes.

b) Dosage des GAG sulfatés par la méthode BlyscanTM _commercial

Cette technique repose sur l'interaction entre le colorant “Blyscan” et les groupements sulfates des GAG (voir partie Matériel et Méthodes et Figure 67). Tous les sulpho-GAG (sGAG) sont donc quantifiés en fonction de leur quantité en sulfates.

Comme précédemment, une gamme étalon en quantité de sGAG connue est établie en fonction de leur absorbance à 630nm. Une droite est tracée à partir des valeurs obtenues et le coefficient de détermination (R²) est calculé à partir de ces mêmes valeurs. Le R² obtenu (0,9959) (Figure 88) est proche de 1 ce qui signifie que l'absorbance à 630nm est proportionnelle à la quantité de sGAG dans l'échantillon.

L'absorbance à 630nm de l'extrait d'HS issu de la digestion à la trypsine de 200 millions

Figure 87 : Dosage par carbazole de l’échantillon pour déterminer la concentration d'HS cellulaires entiers issus de cellules HeLa digérées à la trypsine. La croix rouge correspond à l'absorbance de l'extrait à 530nm

136 de cellules HeLa est lue dans les mêmes conditions que pour la gamme étalon et est de 0,249 pour un volume de 5µL ; c'est-à-dire que pour l'extrait de 100µL une estimation de 25µg en sGAG est obtenue. Cette estimation est inférieure à celle donnée par la méthode de dosage au carbazole, ce qui peut s'expliquer en partie par la perte d'échantillon utilisée pour le précédent dosage. Toutefois, cette estimation est d'autant plus proche de la réalité que la quantité de sulfate par chaine pour les sGAG de la gamme étalon est similaire à celle des HS de l'extrait cellulaire. Les sGAG de la gamme étalon étant en réalité des CS-A (C4S), la quantification en HS de l'extrait est donc surestimée car les HS sont généralement plus sulfatés que les CS.

Le colorant Blyscan se servant des propriétés électronégatives des composés pour se fixer, la fiabilité de la méthode a été testée en fixant du colorant sur l'ADN qui est une molécule poly-phosphatée. Une quantité de 3µg d'ADN entier et digéré ont été mis en présence du colorant dans les mêmes conditions que celles décrites pour les extraits cellulaires. La quantification de l'ADN non fragmenté est totale alors qu'environ un tiers (1,18µg) du colorant a pu se fixer sur le digestat d'ADN.

Ensemble ces résultats suggèrent que le dosage au colorant Blyscan est peu spécifique et nécessite un échantillon pur et une connaissance préalable de la sulfatation de l'extrait afin d'établir une gamme étalon adéquate. Nos extraits de cellules comprenant toujours une certaine quantité en acides nucléiques, il n'est pas possible de calculer directement la quantité en HS dans nos digestats cellulaires.

Enfin, une dernière méthode de quantification, par spectroscopie RMN, a également été mise en place pour estimer la quantité en HS cellulaires.

c) Dosage des HS par RMN

La détermination de la quantité en HS des cellules par RMN est réalisée par comparaison avec un échantillon d'HS de masse connue. Comme vu dans la partie

Figure 88 : Dosage par blyscan de l’échantillon pour déterminer la quantité d'HS cellulaires entiers issus de cellules HeLa digérées à la trypsine. Sur la droite de régression linéaire sont reportées les absorbances à 630nm

137 introduction, l'intensité d'un signal en RMN dépend du temps expérimental (qui lui-même dépend du nombre d'itérations de l'expérience RMN dans les différentes dimensions considérées), du gain et de la quantité en noyaux observables.

Un spectre est enregistré à partir d'un échantillon d'HS commercial de 2mg non- marqué. La quantification est réalisée par l'intégration du volume des pics de corrélation 1_H- 13_{C des glucosamines. Le signal observé dépend donc de la probabilité d'avoir un} 1_{H (99,99%)} directement couplé avec un 13_{C (1,1%) (Figure 54) soit une probabilité de 1,1%. Sur les 2mg} d'HS commerciaux, seulement 20µg sont donc observables. Le volume des signaux des glucosamines observées est 8,2 pour un temps expérimental de 13h15mn (Figure 89).

Notre extrait issu de 200 millions de cellules HeLa, en considérant qu'il est marqué à 100% en 13_{C, analysé en 16h a un volume de pic au niveau des glucosamines de 3,8. En prenant} en compte ce volume en fonction du temps d'expérience comparé à l'échantillon d'HS connu, une dizaine de microgrammes d'HS est ainsi estimée (Figure 89). La quantification par RMN offre l'avantage de pouvoir intégrer des pics appartenant spécifiquement aux HS, et ainsi de ne pas quantifier des contaminants, comme cela est le cas avec le dosage au blyscan. Des biais peuvent cependant être introduits du fait des conditions spectroscopiques différentes (temps expérimental, champ magnétique...) et expérimentalement par les différentes limites d'intégration des pics observés.

En résumé, la quantification des HS cellulaires n'est pas aisée du fait de la complexité de l'échantillon et des réactions ou conditions parasites qui peuvent biaiser les résultats obtenus. Cependant, les différentes méthodes de dosage colorimétrique et spectroscopique permettent d'estimer à environ une dizaine de microgrammes la quantité d'HS obtenue après digestion, extraction et purification à partir de 200 millions de cellules HeLa. Les analyses RMN

Figure 89 : Dosage par RMN d'une fraction d'HS issus de cellules HeLa comparativement à un échantillon commercial de masse connue. Les temps expérimentaux, volumes des pics de corrélation H2-C2 des glucosamines

et des quantités en HS connus ou calculés sont donnés en A. Les spectres HSQC au niveau des pics intégrés sont montrés pour les HS commerciaux (B) et pour l’échantillon de masse inconnu (C).

138 montrent également une quantité non-négligeable d'acides nucléiques dont leur élimination est nécessaire pour pouvoir mettre en place des analyses plus qualitative et quantitative par RMN.