Les protéines d’échafaudage

L’activation de la cascade de signalisation par les MAPKs requière une interaction fine entre les kinases et leurs substrats respectifs. Cette organisation est assurée par les protéines d’échafaudage (ou scaffold proteins), permettant ainsi l’obtention d’un module MAPK fonctionnel. Les premières études concernant ces protéines ont été réalisées chez la levure pour identifier les régulateurs de la signalisation des phéromones Ste11/Ste7/Fus3. Ces études ont mis en évidence que la protéine Ste5 est chargée de l’interaction entre ces trois kinases et les protéines G activées lors de la fixation des phéromones sur son récepteur (Yoshioka, 2004). Chez les mammifères, selon la voie de signalisation activée, la mise en jeu de ces protéines peut varier. Ainsi, certaines protéines d’échafaudage seront spécifiques de la voie ERK et d’autres des SAPKs (Figure 56) (Dard & Peter, 2006).

a) Les protéines d’échafaudage de la voie ERK

Plusieurs ˝scaffold proteins˝ ont été identifiées pour réguler la voie ERK.

La première, KSR (Kinase Suppressor of Ras) fut originellement découverte comme étant un régulateur négatif de la voie Ras chez la drosophile. Chez les mammifères, il existe deux homologues de KSR : KSR1 et 2, dont les fonctions semblent diverger selon le type cellulaire. Toutefois ces deux protéines peuvent interagir avec les protéines G et , Raf, MEK1/2 et ERK1/2 (Figure 57) (Dhanasekaran et al, 2007). Ces protéines possèdent un domaine kinase non fonctionnel. En revanche, il permet la fixation constitutive de MEK. Lors de l’activation de Ras, on observe la liaison de ERK et Raf à KSR. Cette liaison s’accompagne d’une relocalisation de ce complexe au niveau de la membrane plasmique nécessitant la déphosphorylation de KSR au niveau de la sérine 392. La cascade de phosphorylation va avoir lieu et phospho-ERK sera libéré pour transloquer au niveau nucléaire. Les animaux KSR1-/- sont viables et ne démontrent pas de phénotype particulier suggérant des fonctions redondantes entre les deux isoformes de KSR (Morrison & Davis, 2003).

Une autre protéine a été identifiée comme favorisant l’assemblage de la voie ERK est MEK-partner 1 (MP1) (Figure 57). Cette petite protéine de 13 kDa, favorise la liaison et l’activation de MEK1/ERK1, et n’interagit pas avec les kinases MEK2 et ERK2. De plus, la surexpression de MP1 provoque une augmentation de l’interaction ERK1/MEK1, de la phosphorylation de

Figure 56: Schéma de la régulation des MAPKs par les protéines d’échafaudage chez la levure et les cellules de mammifère. A) Chez la levure, la réponse aux phéromones requière la mise en place d’un module MAPK Ste11>Ste7>Fus3. Ce module est stabilisé par une protéine d’échafaudage Ste5. B) Ce même schéma est conservé chez les mammifères dans les réponses MAPK-dépendantes aux récepteurs tyrosine kinase ou couplés aux protéines G (extrait de Dhanasekaran D.N. et al., 2007).

B)

Figure 57: Protéines d’échafaudage impliquées dans la régulation de la signalisation ERK-dépendante, exemples de MP1, KSR et MORG1 (extrait de Dhanasekaran D.N. et al., 2007).

71 ERK1, et de l’activité transcriptionelle de Elk-1. MP1 possède une localisation au niveau de la membrane cytoplasmique des endosomes. Cette localisation s’explique par une interaction constitutive de MP1 avec p14, une protéine endosomale. Cette liaison MP1-p14 est essentielle pour une activation complète. En effet, la déplétion de p14 par siRNA provoque le relarguage de MP1 au niveau cytoplasmique et une inhibition de la signalisation ERK (Morrison & Davis, 2003).

MORG1 est une protéine de 35KDa pouvant également moduler la signalisation de ERK. Cette protéine fut isolée par sa capacité à lier MP1. MORG1 peut s’associer directement avec plusieurs éléments de la voie ERK : Raf-1, b-Raf, MEK1/2 et ERK1/2 (Figure 57) (Vomastek et al, 2004). La surexpression de MORG1 induit une suractivation de la voie ERK en réponse au sérum. A l’inverse, son extinction atténue cette réponse. Plus intéressant, MORG1 semble avoir un rôle différent selon le type de stimuli. En effet, si cette ˝scaffold protein˝ augmente la signalisation ERK-dépendante en réponse au LPA ou aux esters de phorbol, en revanche elle n’affecte en rien la réponse à l’EGF. Ceci suggère un rôle de MORG1 dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G plutôt que dans celle des récepteurs à tyrosine kinase. Toutefois, on ne connaît pas la finalité de l’interaction MORG1/MP1. Comme ces deux protéines peuvent co-localiser au niveau de structures vésiculaires, il est possible que cette coopération influe sur la stabilité du signal à des niveaux sub-cellulaires précis (Dhanasekaran et al, 2007).

La paxillin est une protéine de 68 kDa localisée au niveau des foci d’adhésion et modulant la réponse FAK-dépendante à l’Hepatocyte Growth Factor (HGF). Dans les cellules quiescentes, la paxillin est constitutivement liée à MEK. Cependant, après traitement à l’HGF, Src activée va phosphoryler la paxillin sur la tyrosine 118, provoquant le recrutement de ERK et Raf et donc le déclenchement de la cascade de phosphorylation. ERK activée pourra à son tour phosphoryler d’autres protéines du complexe au niveau du foci d’adhésion, dont la paxillin, induisant le recrutement de la FAK à ce niveau cellulaire (Figure 58) (Dhanasekaran et al, 2007).

La β-arrestin joue un rôle dans la désensibilisation des signaux provenant des RCPG et activant ERK (Figure 58). Ainsi après stimulation par un agoniste d’un de ces récepteurs, la β-arrestin transloque du cytoplasme vers la membrane et interagit directement avec le RCPG activé. Ceci a pour conséquence le découplage du récepteur vis-à-vis des protéines G inhibant ainsi la transduction du signal. Les trois isoformes de ERK ont ainsi été retrouvées dans le complexe RCPG/β-arrestin. C’est notamment le cas après activation des récepteurs AT1aR

(Angiotensin Type 1a Receptor) ou PAR2 (Protease Activated Receptor 2). De multiples indices démontrent que la β-arrestin contribue à l’activation RCPG dépendante de ERK. Ainsi la surexpression d’un dominant négatif de la β-arrestin diminue l’activation de ERK. A l’inverse, sa surexpression dans des cellules traitées avec de l’angiotensine (agoniste de AT1aR) augmente l’activation mais aussi la séquestration de ERK au niveau membranaire, inhibant la réponse transcriptionnelle au stimulus. En revanche, on ne connaît pas le mécanisme d’assemblage de ce complexe (Morrison & Davis, 2003).

Enfin, MEKK1 joue, en plus de sa fonction de MAP3K, un rôle de ˝scaffold protein˝. Cette hypothèse repose sur les travaux de Karandikar et al. (Karandikar et al, 2000) qui ont montré une interaction constitutive de MEKK1 avec Raf-1, MEK1 et ERK2.

b) Les protéines d’échafaudage de JNK

De la même manière, la signalisation de JNK est régulée par des protéines d’échafaudage. Les plus étudiées sont les JIPs (JNK Interacting Proteins). Cette famille comporte 4 protéines JIP1, 2, 3 et 4 issues de la transcription de quatre gènes différents. Ces isoformes de JIP ont été séparées en deux sous groupes sur la base de leurs structures protéiques : JIP1 et 2 possèdent des domaines SH3 (Src Homology domain 3) et PTB (domaine de liaison aux phospho-tyrosines) alors que JIP3 et 4 ont des domaines ˝coil-coiled˝ et transmembranaire (Koushika, 2008). JIP1 et 2 étant proches structurellement, leurs fonctions sont similaires (Figure 59). JIP1/2 peut assembler spécifiquement les trois intermédiaires du module MAPK: MLK/MKK7/JNK, facilitant l’activation de JNK. Il a également été montré que JIP2 peut moduler la voie p38 en liant MKK3, p38α et p38γ(Figure 60). Egalement, les JIP1/2 peuvent lier la phosphatase MKP7, supposant que ces protéines d’échafaudage peuvent réguler négativement la voie des SAPKs.

JIP3 (ou JSAP1) a été identifiée comme étant un partenaire de JNK1. Toutefois, cette protéine peut aussi interagir avec MEKK1, MLK3, ASK1, MKK4/7. Au niveau des MAPKs, JIP3 s’associe préférentiellement à JNK3 plutôt qu’à JNK1/2 (Figure 60).

Enfin, la protéine d’échafaudage JIP4 peut lier les kinases MEKK3, MKK4 et JNK. Toutefois, les études fonctionnelles de JIP4 semblent indiquer que cette protéine régule plus favorablement la voie p38 (Figure 60) (Lee et al, 2002; Morrison & Davis, 2003; Thompson et al, 2001).

D’autre part comme pour la signalisation ERK, la β-arrestin 2 peut moduler la signalisation de JNK. Elle interagit avec JNK3 et ASK1. Elle peut également lier MKK4 mais de façon

Figure 60: Rôles des protéines d’assemblage de la famille des JIPs. Quatre JIPs ont été identifiées. Parmi elles, JIP1 et 3 sont spécifiques de la voie JNK. En revanche, JIP2 et 4 peuvent réguler à la fois la signalisation de JNK et de p38 (extrait de Dhanasekaran D.N. et al., 2007). Figure 59: Structures protéiques des protéines d’assemblage JIP1 et 2. Ces deux protéines d’assemblage ont des structures similaires, leur permettant de recruter les kinases de chaque niveau du module MAPK. Le domaine JBD permet la liaison de la MAPK : JNK alors que le domaine PTB reconnaît les phospho-tyrosines. SH3 : Src Homology domain 3, PTB : Phosphotyrosine-Binding domain, JBD : JNK-Binding Domain (extrait de Dhanasekaran D.N. et

indirecte. La β-arrestin 2 est nécessaire pour l’activation de JNK3 après stimulation du récepteur de l’angiotensine 2.

c) Les protéines d’échafaudage de p38

Concernant la régulation de la voie p38, peu de protéines d’échafaudage ont été identifiées. Neanmoins, de récentes données indiquent que les JIP2 et JIP4 peuvent interagir avec p38 (Figure 60). JIP2 peut lier les isoformes α et γ de p38 ainsi que sa MAP2K : MKK3. Par exemple, Buchsbaum et al. (Buchsbaum et al, 2002) ont réalisé des expériences de transfections de plasmides codant pour des allèles constitutivement actifs de Tiam1 et Ras-GRF1, deux ˝guanines exchange factors˝ pouvant activer p38 par l’intermédiaire de la voie Rac>MLK3>MKK3. Cette induction est potentialisée par la cotransfection d’un plasmide JIP2, favorisant l’assemblage de cette voie de signalisation et donc l’activation de p38.

Concernant JIP4, l’équipe de R. Davis a montré que cette protéine module plus favorablement la voie p38 (Figure 60). La surexpression de JIP4 n’affecte pas l’activité de JNK alors qu’elle potentialise celle de p38. Ils ont pu mettre en évidence une interaction directe entre p38α et ASK1. Cependant, ils n’ont pas pu détecter d’interaction entre JIP4 et une MAP2K malgré que la surexpression de JIP4 soit incapable de potentialiser l’activité de p38 dans les cellules MKK3-/- ou MKK6-/-. Ceci suggère que ces MAP2Ks ainsi que JIP4 sont indispensables à la transduction du signal par la voie p38 (Kelkar et al, 2005)

Enfin, une protéine d’échafaudage spécifique de la voie p38 a récemment été identifiée par le laboratoire de GL. Jonhson : l’OSM (Osmosensing Scaffold for MKK3). L’extinction de OSM par siRNA atténue l’activation de p38 par un choc osmotique. A l’inverse, des expériences de FRET montrent une augmentation de l’interaction OSM/MKK3 lors du traitement au sorbitol (Uhlik et al, 2003).

4. Rôles des MAPKs dans la réponse un déficit en acides