Eléments activateurs du module MAPK au cours d’une carence en acides aminés 94

3.1. Rôles des GTPases Rac1 et Cdc42

Le module MAPK impliqué dans la phosphorylation d’ATF2 est contrôlé par deux GTPases Rac1 et Cdc42. Nos résultats suggèrent des fonctions redondantes de ces deux GTPases dans l’activation de la voie G12/ATF2. Cet aspect a déjà été décrit dans de nombreuses publications traitant de leurs rôles dans l’activation plaquettaires, la régulation de la formation du cytosquelette et du trafic vésiculaire (Frank et al, 2006; Kurokawa et al, 2004).

Ces deux protéines ont été particulièrement étudiées pour leurs rôles dans la régulation de la réorganisation du cytosquelette (pour revue (Heasman & Ridley, 2008)). Ces données de la littérature peuvent être mises en regard avec nos précédentes analyses transcriptomiques. Celles-ci ont mis en évidence que de nombreux gènes induits par la carence en acides et impliqués dans la réorganisation du cytosquelette. Parmi ceux-ci, la zyxin a déjà été décrite comme pouvant être régulée par Rac1 et Cdc42 (Castellano et al, 1999; Tufvesson & Westergren-Thorsson, 2003). Toutefois, ces données de puces à ADN doivent être confirmées par analyses de qPCR. Par la suite, des mesures de l’expression de la zyxin, et d’autres gènes, pourraient être envisagées dans les cellules knock-down pour Rac1 et Cdc42, carencée ou non en leucine.

De plus, il est clairement démontré dans la littérature qu’une carence en acides aminés provoque la mise en place de mécanismes autophagiques afin de palier à la privation de ce type de nutriments (pour revue (Chang et al, 2009)). Or, récemment, l’équipe de SJ. Lee a montré que la voie Rac1/MKK7/JNK, trois intermédiaires communs à la voie G12/ATF2, était nécessaire pour la mise en place de l’autophagie induite par l’oncogène V-Ras. Dans ce même contexte, ce groupe démontre que cette voie permet l’induction de l’expression de Atg5, protéine impliquée dans la formation de vacuoles autophagiques (Byun et al, 2009). On peut alors émettre l’hypothèse que, en réponse à la carence en acides aminés, l’activation de cette même voie participe à l’instauration de ces phénomènes autophagiques afin de compenser la carence en acide aminés.

Afin de vérifier cela, nous envisageons d’évaluer l’induction des gènes marqueurs de la mise en place des mécanismes d’autophagie comme Atg5, dans les cellules knock-down pour Rac1.

3.2. Identification des partenaires de G12

a) Sous-unités G et G

Le dernier élément régulateur identifié de cette nouvelle voie est G12. Cette protéine fait partie de la famille des protéines GTPases liées à la surface interne de la membrane cellulaire et forme un hétérotrimère avec deux autres sous-unités G et G. A l’état basal, les protéines G sont constitutivement fixées à une molécule de GDP. Dans ce cas, le dimère G inhibe la libération spontanée de GDP. On parle alors d’activité GDI (Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor) de G vis-à-vis de G. Les protéines G et G sont donc des régulateurs importants de la transduction du signal. Dans notre modèle de carence en leucine, il est donc important de déterminer les isoformes de ces protéines et ainsi préciser notre schéma de régulation de la voie G12/ATF2 par la privation en acides amines. Chez l’homme, cinq sous-unités G et douze sous-sous-unités G ont été identifiées (Tableau 10) (Schwindinger & Robishaw, 2001). Parmi elles, certaines ont une expression tissulaire très restreintes (G1, G5) et ne sont donc pas de bons candidats pour notre étude. Egalement, plusieurs d’entre elles sont connues pour moduler l’activité de certaines MAPKs. Ainsi l’isoforme G4 a été démontrée comme activateur de la voie PI3K/Raf-1/ERK1/2 en réponse au traitement à la dihydrotestostérone (DHT) (Zagar et al, 2004). Le dimère G12 est impliqué dans l’activation des SAPKs (p38 et JNK) en réponse aux UV et est essentiel pour l’induction transcriptionnelle de CHOP et c-Jun au cours de ce même stimulus (Seo et al, 2002). Des expériences d’invalidation ou de surexpression des ces protéines G pourraient être réalisées dans un contexte de carence en leucine afin de vérifier si elles jouent un rôle dans l’induction de la voie G12/ATF2.

b) Guanine exchange Factors (GEFs)

Les Guanine Exchange Factors (GEFs) sont une autre classe de protéines régulatrices des sous-unités G. A l’état basal, G, sous sa forme inactive, est couplée à une molécule de GDP. Lors de l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G, celui-ci adopte un changement de conformation facilitant l’échange du GDP par un GTP (Figure 68). Ceci provoque alors la dissociation du trimère G. Le chargement de G par du GTP est assuré par les protéines GEFs et va permettre la phosphorylation de GTPases en aval (Sikorski & Buratowski, 2009).

Dans le cas d’une carence en leucine, nous avons montré que la protéine G12 induisait la voie de signalisation via les GTPases Cdc42+Rac1. Afin d’activer ces deux protéines, G12

Tableau 10: Protéines G et G et leurs localisations tissulaires chez l’homme. Chez l’homme, seulement 5 protéines G et 12 G ont été identifiées. Ces protéines ont également des répartitions tissulaires différentes (d’après Schwindinger W.F. et Robishaw J.D., 2001).

Figure 68: Rôle des Guanine Exchange Factors (GEFs) dans la régulation de l’activité de la sous-unité G. Lors de l’activation d’un RCPG, le changement de conformation du récepteur induit l’échange de GDP pour du GTP au niveau de la sous-unité G. Cette étape est assurée par les GEFs. La terminaison du signal se fait par l’intermédiaire des GAPs, chargées d’hydrolyser le GTP. 7TM-Receptor : Récepteurs à 7 domaines transmembranaires (d’après Siderovski D.P. et Willard F.S., 2005).

doit être rechargée en GTP par l’intermédiaire d’un GEF. La famille des RhoGEF a été la plus étudiée. Trois protéines de cette famille sont connues pour interagir avec G12 et/ou G13 : p115RhoGEF, PDZ-RhoGEF et LARG et réguler positivement leurs activités. Ces 3 facteurs ont la particularité d’avoir un domaine spécifique RGS (Regulator of G-protein Signaling) leur permettant d’interagir directement avec G12/13 (Figure 69) (Bhattacharyya et al, 2009) (Tanabe et al, 2004). De plus, les protéines LARG et PDZ-RhoGEF semblent plus impliquée dans la régulation de l’activité de G12 (Sternweis et al, 2007). On peut envisager d’invalider spécifiquement chacune de ces protéines et regarder l’impact de ce traitement sur la phosphorylation de JNK2 et d’ATF2.

Bien que ces différentes protéines soient des régulateurs potentiels importants de la voie G12/ATF2, nous avons fait une priorité d’identifier le récepteur membranaire en amont de cette protéine G. La méthodologie envisagée est décrite dans la partie suivante.

3.3. Identification du récepteur membranaire

Le récepteur à l’origine de cette voie de signalisation reste à déterminer et est une priorité de recherche au sein du laboratoire. Le fait que G12 soit impliquée dans cette voie nous oriente sur un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), la principale difficulté de ce travail est de trouver le récepteur d’intérêt dans la plus grande famille de protéines membranaires (Figure 70). En effet, on considère actuellement que le génome humain comporte 853 gènes codant chacun pour un RCPG. Parmi eux, 478 codent pour un récepteur impliqué dans la ˝chémosensation˝ (récepteur olfactif ou du gout) et 375 peuvent avoir de multiple ligands comme les amines biogénique (ex : histamine), acides aminés, peptides, nucléotides ou lipides. Nombre d’entre eux (environ 120) n’ont pas de ligand connu et sont donc qualifiés ˝d’orphelins˝ (Oh et al, 2006). A cela, s’ajoute un second degré de complexité au niveau de la fonctionnalité de ces récepteurs. En effet, 60 RCPG sont décrits comme ayant une activité constitutive (indépendamment de la fixation d’un ligand) (Seifert & Wenzel-Seifert, 2002). Enfin, il est désormais acquis qu’un RCPG n’agit pas en tant que monomère. Cette famille de récepteur peut s’associer avec d’autres membres des RCPG et/ou d’autre classes de protéines pour former un dimère voire un oligomère et activer de multiples voie de signalisation (Chung et al, 2008; Iismaa et al, 2006). Ceci suppose que plusieurs récepteurs pourraient être impliqués dans la réponse à la carence en acides aminés.

Notre seul crible pourrait être de sélectionner les récepteurs connus pour être couplés à la protéine G12. Tout d’abord, pour beaucoup de RCPG, la protéine G qui leur est associée n’est pas encore déterminée. De plus, un même récepteur peut recruter différentes protéines

Figure 69: Structures protéiques des RhoGEFs : p115-RhoGEF, LARG et PDZ-RhoGEF. Ces 3 protéines possèdent entre autres un domaine commun : le domaine RGS qui leurs permettent d’interagir spécifiquement avec les protéines G12/13. Le domaine DH (Dbl Homology) permet de lier le GTP et les GTPases de la famille des Rho (par exemple : Cdc42 ou Rac1) alors que le domaine PH (Pleckstrin Homology domain) permet la localisation cellulaire du GEF. Le segement PDZ uniquement présent pour LARG et PDZ-RhoGEF serait impliqué dans la liaison entre le GEF et les récepteurs couplé aux protéines G (extrait de Tanabe et al., 2004).









 Gènes ATF2-dépendants









_αααα



?



-Figure 70: Identification du récepteur couplé à la protéine G12 et activé au cours d’une carence en leucine.

type de G en fonction du ligand et du type cellulaire dans lequel il est activé (Dalrymple et al, 2008; Tobin et al, 2008). Il est difficile d’envisager une approche ciblée d’invalidation génique, seule une approche globale pourra être pertinente, notamment par l’intermédiaire d’une banque dirigée contre les RCPG. Comme expliqué en partie 1.1.3, ce type d’approche nécessite le développement d’un crible permettant de mesurer facilement l’activité d’ATF2 et qui n’est pas encore disponible.

Au laboratoire, nous avons fait le choix d’une alternative à cette technique, en développant des outils cellulaires par génétique fonctionnelle. Ainsi, nous avons sélectionné des cellules capables de se développer dans un milieu très appauvri en acides aminés. Les premières analyses réalisées sur les clones sélectionnés (clones –AAr) ont montré une phosphorylation basale d’ATF2 plus forte que dans les cellules parentales (Figure 71). De plus, ces cellules conservent leurs capacités de réponse à la carence totale en leucine. Les analyses transcriptomiques réalisées sur ces cellules -AAr ont permis d’identifier plusieurs RCPG surexprimés à l’état basal. Il est prévu de réaliser une invalidation spécifique par siRNA de chacun d’entre eux afin de vérifier si la phosphorylation d’ATF2 est affectée en réponse à une carence en leucine. Par la suite, des expériences de surexpression du RCPG d’intérêt ou d’invalidation du gène seront à envisager.

4. Autres cibles et rôle de la voie G12/ATF2 dans la