La protéine RPA

Son rôle biologique

La protéine RPA, identiée par M. Wold en 1988 (Wold and Kelly, 1988), est un facteur essentiel pour la réplication de l'ADN, mais aussi pour la répa-ration de l'ADN et l'activation des points de contrôle (notamment l'activation des kinases ATM et ATR). Par conséquent la présence de RPA est régulée né-gativement aux télomères pendant l'interphase. Cependant l'implication de RPA dans le maintien des télomères a été mise en évidence au sein des levures S. cerevisiae et S. pombe (Smith et al., 2000; Ono, 2003), où elle est présente aux télomères au cours de la phase S. Notamment chez la levure S. pombe, il a été montré que pRPA est importante dans la synthèse correcte du lagging strand (Brin G) (Moser and Nakamura, 2009; Luciano et al., 2012; Audry et al., 2015). Chez l'homme, RPA est présente aux télomères humains lors de la réplication (Verdun and Karlseder, 2006; Déjardin and Kingston, 2009) et est impliquée dans le maintien des télomères (KOBAYASHI et al., 2010). Par ailleurs, Cohen et al. ont montré que la RPA humaine pouvait réguler l'activité in vitro de la télomérase probablement en déroulant les structures non usuelles présentes dans l'ADN télomérique (Cohen et al., 2004).

Sa structure

La protéine RPA se présente sous la forme d'un hétérotrimère composé de trois sous-unités : RPA1, RPA2, RPA3, de masses respectives 70, 32 et 14 kDa (Figure 1.22). Chaque sous-unité possède un ou plusieurs motifs OB fold qui permettent la liaison à l'ADN simple brin (DBD = DNA binding Do-main) ou l'interaction avec d'autres protéines. La sous-unité RPA1 se com-pose d'un domaine d'interaction protéine-protéine situé en N-term (DBD-F), et de trois domaines OB fold de liaison à l'ADN simple brin : A,

DBD-B et DDBD-BD-C. La sous-unité RPA2 se compose de trois domaines. Un petit domaine non structuré situé en N-term qui contient de nombreux sites de phosphorylation (Gomes et al., 1996; Zernik-Kobak et al., 1997), un domaine OB fold central de liaison à l'ADN simple brin DBD-D, et enn un domaine Winged Helix(WH) en C-term qui permet des interactions protéine-protéine, notamment avec celles impliquées dans la réparation comme RAD52, XPA (Mer et al., 2000). La sous-unité RPA3 est composée d'un unique domaine OB fold (DBD-E), dont un point de contact avec l'ADN simple brin a été mis en évidence en 2009 par photopontage (Salas et al., 2008). Ce domaine OB-E est essentiel pour la trimérisation de RPA. En eet cette trimérisation de la protéine RPA est assurée par les domaines : DBD-C (RPA1), DBD-D (RPA2) et DBD-E (RPA3).

Figure 1.22  Les domaines structuraux et fonctionnels de RPA. Il existe plusieurs structures haute résolution des sous-unités de RPA ( ' 40 sur la PDB). Ne pouvant pas présenter chacune d'elle, j'ai pris le parti de choisir deux structures qui me semblent complémentaires et donnent une bonne vision structurale de RPA. La première structure est celle des do-maines DBD-A et DBD-B de RPA1 résolue par cristallographie en présence d'une polyCytosine (8 nt) (Figure 1.23) (Bochkarev et al., 1997). On observe comme avec POT1 deux domaines OB fold de liaison à l'ADN simple brin.

On notera que les domaines chez RPA sont alignés contrairement à ce qui avait été observé en présence de POT1. Nous reviendrons sur les diérences entre POT1 et RPA quand nous aborderons le mécanisme de liaison de RPA. La seconde structure que j'ai choisie de présenter est la structure cristallogra-phique des domaines permettant la trimérisation des sous-unités de RPA : DBD-C (RPA1), DBD-D (RPA2) et DBD-E (RPA3) (Figure 1.24) (Bochka-reva, 2002). On observe que la trimérisation est assurée par les trois hélices C-terminales des domaines OB fold disposées en parallèle.

Figure 1.23  Structure cristallographique des domaines DBD-A et DBD-B de RPDBD-A1 en présence d'une polyCytosine (8 nt) (PDB :1JMC) . (Bochkarev et al., 1997)

Figure 1.24  Structure cristallographique des domaines DBD-C, DBD-D et DBD-E assurant la trimérisation du complexe RPA (PDB :1L1O) . (Bochkareva, 2002)

Même s'il n'existe aucune structure complète du complexe RPA humain, il est important de noter que l'hétérotrimère RPA est hautement conservé au sein des eucaryotes notamment de par sa séquence et de par sa structure. En 2012 Fan et al. ont résolu la structure quasi complète de la protéine RPA du champignon Ustilago maydis en présence d'un polyT avec une résolution de 3.1 A (Figure 1.25) (Fan and Pavletich, 2012). Malgré l'absence du domaine DBD-F de la sous-unité RPA1 et du domaine WH de la sous-unité RPA2 cette structure cristallographique est la plus complète de la protéine RPA à ce jour. On retrouve la structure de la liaison à l'ADN médiée par les domaines DBD-A et DBD-B de RPDBD-A1 similaire à l'humaine vu précédemment ; ainsi que la structure de la trimérisation des trois sous-unités par l'intermédiaire des hélices C-terminal des domaines DBD-C (RPA1), DBD-D (RPA2) et DBD-E (RPA3). Cette structure quasi complète de RPA nous révèle l'agencement de ces diérents domaines OB fold mais également décrit son mode de liaison par ces quatre domaines de liaison. On observe que RPA se lie à l'ADN simple brin à la fois par les domaines DBD-A et DBD-B d'une part, et d'autre par DBD-C et DBD-D induisant une conformation en forme de U à l'ADN.

Figure 1.25  Structure cristallographique de RPA du champignon Ustilago maydis en présence d'un polyT (PDB :4GOP)55 A. Les

do-Son mécanisme de liaison à l'ADN

La protéine RPA est une protéine OB fold qui contrairement à la pro-téine POT1 appartient à la catégorie des propro-téines qui se lient aux acides nucléiques sans spécicité de séquence. Les domaines DBD-A et DBD-B sont dénis comme les domaines de haute anité à l'ADN simple brin, alors que les domaines DBD-C et DBD-D montrent quant à eux une faible anité (Bochkarev, 1999). Concernant les domaines DBD-E et DBD-F, aucune acti-vité de liaison à l'ADN n'a jamais été observée. Toutefois des expériences de photopontage ont permis de mettre en évidence l'existence d'un contact de la sous-unité RPA3 avec l'ADN (Salas et al., 2008). Les domaines DBD-A et DBD-B lient l'ADN principalement à l'aide de liaison hydrogène. Les acides aminés impliqués dans ces liaisons hydrogène se situent majoritairement au sein des feuillets β1 et β3. On dénombre un total de 21 liaisons hydrogène entre les domaines de liaisons DBD-A et DBD-B et l'ADN simple brin (Fi-gure 1.26) (Bochkarev et al., 1997), dont 12 liaisons hydrogène avec les bases et 9 liaisons hydrogène avec les groupements phosphate. Une partie des liai-sons hydrogène avec les bases fait intervenir les couples donneur/accepteur Watson-Crick. En revanche, RPA présente un faible nombre, contrairement à POT1, de résidus aromatiques impliqués dans l'empilement des bases, à savoir 2 Phe pour DBD-A et 1 Phe et Trp pour DBD-B. L'absence de spé-cicité de séquence pourrait donc s'expliquer par la part non négligeable de liaison hydrogène avec les groupements phosphates, contrairement à ce qui est observé pour POT1 ; mais également par un plus faible empilement des bases entre elles.

Le mécanisme de liaison de RPA à l'ADN simple brin se compose de plusieurs étapes et est associé à un changement conformationnel signicatif démontré par des méthodes de biochimie, de microscopie électronique et de cristallographie (Iftode et al., 1999). Il existe trois modes décrits de liaison de la protéine RPA à l'ADN simple brin :

Une conformation compacte (recouvrant 8-10 nt). La liaison est assurée par les domaines DBD-A et DBD-B (Pfuetzner et al., 1997; Walther et al., 1999) qui recouvre une région de 8-10 nt. Dans ce mode de liaison, RPA lie de manière compacte et de façon instable (Blackwell and Borowiec, 1994).

Une conformation allongée contractée (recouvrant 12-23 nt). La liai-son est entreprise par les domaines OB fold précédent (A et DBD-B) auquel s'ajoute le domaine DBD-C (Cai et al., 2007). Dans ce mode de liaison, RPA se lie à l'ADN simple brin avec une anité plus élevée que celle de la conformation compacte (8-10 nt).

s'eectue par les domaines DBD-A et DBD-B auxquels s'ajoutent les domaines mineurs à savoir DBD-C et DBD-D (Kim et al., 1992; Boch-kareva et al., 1998).

Figure 1.26  Diagramme montrant les contacts de RPA avec un polyCytosine (C8).Les bases sont numérotés de 1 à 8 à partir de l'extrémité 5 ', et les numéros ont été placés dans les bases correspondantes. Les liaisons hydrogène entre l'ADN et les résidus sont indiqués par des lignes pointillées. Les résidus aromatiques qui empilent les bases sont marquées en gras. (Bochkarev et al., 1997)

Une étude en présence d'un polyT montre que RPA lie l'ADN avec une faible coopérativité (Kim and Wold, 1995). Outre les modes de liaison cités ci-dessus, Pokherel et al. ont montré chez Saccharomyces cerevisiae que RPA possède une multitude de modes liaisons qui permettent de libérer soit le côté 3', soit le côté 5' an de favoriser l'accès à diérentes protéines, comme par exemple RAD52 impliqué dans les voies de réparation de l'ADN et recruté par le domaine DBD-D de RPA2 (Pokhrel et al., 2019). En 2001 une étude a montré que la sous-unité RPA1 interagit principalement avec l'extrémité 5' de l'ADN, quelle que soit la structure de l'ADN, déterminant ainsi une polarité de liaison à l'ADN de 5' vers 3' de RPA (Kolpashchikov, 2001). RPA ne lie pas ou très peu l'ADN double brin (1000 fois moins ane pour le double brin et l'ARN), toutefois elle est capable de lier l'ADN double brin

contenant des régions simple brin internes (appelées boucles) ou présentes aux extrémités et de le dérouler (Iftode et al., 1999; Salas, 2005; Delagoutte et al., 2011).