Le complexe POT1-TPP1 peut-il prendre en charge ces multimères de G4s en tandem ?ces multimères de G4s en tandem ?

De nombreuses équipes de recherche ont étudié les interactions de POT1 ou POT1-TPP1 sur de longues séquences télomériques contenant des répéti-tions importantes du motif TTAGGG. Ces études sont au nombre de quatre et sont présentés ci-dessous.

La première étude a été réalisée en 2010 par H. Wang et al., sur molécule unique, par microscopie à force atomique atomic force microscope (AFM)). Elle montre que la protéine POT1 seule peut dérouler des structures G4 présentes sur de longues séquences télomériques (48-nt, soit 8 répétitions, et 96-nt, soit 16 répétitions), en présence de potassium (Wang et al., 2010). Toutefois, dans les conditions d'analyse, les auteurs ont observé que la ma-jorité de l'ADN ne forme que la moitié des G4 théoriquement possibles, et que ces derniers ne sont pas disposés en tandem.

La seconde étude a été menée par l'équipe de Thomas R. Cech en 2011 avec de longues séquences télomériques de 72-(12 répétitions) à 144-nt (24 ré-pétitions) (Taylor et al., 2011). Cette étude révèle que POT1 et POT1-TPP1 sont capables de recouvrir complètement ces longues séquences ; l'observation sur gel de complexes intermédiaires non saturés suggère que ces évènements de liaison sont peu ou pas coopératif. L'analyse par microscopie électronique (ME) montre que les complexes formés avec la séquence télomérique de 144-nt saturée par 12 hétérodimères POT1-TPP1, forme144-nt des structures globu-laires compactes homogènes, reétant un assemblage ordonné des protéines sur l'ADN (Figure 2.2 Toutefois, bien que les conditions expérimentales (pré-sence de sodium) permettent à ces longs oligonucléotides de se structurer in vitro en G4s contigus, certes moins stables qu'en potassium, l'étude n'aborde pas cet aspect.

Figure 2.2  Microscopie électronique à coloration négative des complexes POT1-TPP1 en présence d'un ADN télomériques (144 nt).(a) Une micrographie typique de complexes télomériques assemblés à partir d'ADN télomérique de 144 nt saturé par douze hétérodimères POT1-TPP1. Les particules sont de forme globulaire et monodispersées sur la grille. (b) Classica-tion 2D des complexes télomériques 144nt-POT1-TPP1 (Taylor et al., 2011)

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La troisième étude a été réalisée en 2013 par Corriveau et al. avec une séquence télomérique de 48-nt (8 répétitions), et a également montré que plusieurs complexes POT1-TPP1 peuvent recouvrir complètement l'ADN (Corriveau et al., 2013). Toutefois l'oligonucleotide choisi pour leur étude, (GGTTAG)8, ne présentant que sept blocs de trois guanines successives, ne permet pas de former deux G4s, mais uniquement un seul G4. La suite de l'étude a consisté à étudier l'interaction de POT1-TPP1 avec des séquences mutées du 48-nt, ne pouvant plus former de structure en G-quadruplexe (rem-placement des deux guanines situées entre les motifs de liaison de POT1, par des cytosines : 5'-(CCTTAGGGTTAG)4-3') et possédant un motif de liai-son de POT1 muté (remplacement d'une des guanines du motif de liailiai-son de POT1, par un cytosine : 5'-(TTAGCGTTAG)-3'). Dans ce contexte même si leurs séquences conservent le même nombre de sites de xation de POT1-TPP1, elles forment maintenant des structures tige-boucle non représentatif du G-overhang in vivo (Mullins et al., 2016). L'objectif de cette étude était d'étudier l'eet de la structure G4 sur la liaison du complexe et de tester l'idée d'une coordination de la liaison de 3' vers 5' des protéines le long de l'ADN, idée basée sur l'observation que POT1 possède une préférence pour l'extrémité 3' du brin G. Si les résultats montrent clairement que la présence d'un G-quadruplex peut inuencer le mécanisme de liaison des protéines, les résultats obtenus avec les séquences mutées dans le motif de POT1 ne permettent pas d'avancer un modèle de liaison coordonné et directionnel.

Figure 2.3  Liaison séquentielle de POT1-TPP1 .A. Diagramme des séquences d'ADN étudiées. Les barres pleines au-dessus de la séquence indiquent les sites de liaison POT1 individuels. Les lignes en pointillées indiquent une mutation de G en C* dans le site de liaison de POT1 de l'ADN. B-C-D. Les expériences de EMSA en présence des diérentes séquences. Les complexes POT1-TPP1-ADN de diérentes st÷chiométries ont été quantiés. (Corriveau et al., 2013)

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Enn, la dernière étude publiée en 2019 par l'équipe de Derek J. Taylor a été réalisée (Xu et al., 2019) avec une POT1 possédant une mutation H266L, et, soit une séquence courte de 12-nt (H12 ; 5'-GGTTAGGGTTAG-3'), soit une séquence longue de 72-nt (H72), en présence de sodium. Les résultats montrent que l'acide aminé H266 est essentielle pour permettre la liaison de POT1-TPP1 à la séquence (H12) (Figure 2.4.A-B), ce qui n'est pas le cas avec (H72) (Figure 2.4.C-D). Ce résultat montre que POT1-TPP1 ne se com-porte pas de la même façon sur de courtes séquences télomériques comparé à des séquences plus longues, sous-entendant un mode de liaison diérents en fonction de la taille de l'oligonucléotide. Bien que la séquence télomérique H72 puisse se structurer in vitro en trois G4s contigus, l'article n'aborde pas cette dimension G4 et par conséquent ne traite pas du comportement de POT1-TPP1 sur des séquences formant des G4s en tandem.

Figure 2.4  L'ecacité de liaison du mutant POT1(H266L)-TPP1 est dépendante de la longueur du substrat de l'ADN simple brin.

A. EMSA pour comparer l'eet des mutations de POT1 sur la liaison du complexe POT1-TPP1 en présence d'un court ADN télomérique (12 nt). B. Quantication des données EMSA pour POT1-TPP1 et les protéines mutants en présence d'un court ADN télomérique (12 nt). C. EMSA pour comparer l'eet des mutations de POT1 sur la liaison du complexe POT1-TPP1 en présence d'un long ADN télomérique (72 nt). D. Quantication des données EMSA pour POT1-TPP1 et les protéines mutants en présence d'un long ADN télomérique (72 nt). (Xu et al., 2019)

En résumé, les diérentes études des interactions de POT1 et POT1-TPP1 avec de longues séquences télomériques ont montré que ces protéines peuvent recouvrir entièrement l'ADN et ouvrir les G-quadruplexes. Toute-fois, dans la grande majorité des cas, ces études ont été réalisées en présence de sodium, une condition saline qui n'est pas biologiquement représentative, puisque dans la cellule il y a une concentration importante de potassium qui joue un rôle stabilisateur des G4. Quant à la seule étude faite en potassium, elle a été réalisée sur des ADN qui ne forment que très rarement des mul-timères de G4 en tandem. A ce jour, il n'y a donc eu aucune étude sur la liaison et l'ouverture de de G4 télomériques en tandem en potassium par la protéine POT1 et/ou le complexe POT1-TPP1.