Le complexe POT1-TPP1

Son rôle biologique

La protéine POT1 (Protection of Telomere 1), découverte par Baumann en 2001 (Baumann and Cech, 2001), joue un rôle de protection des télomères. Ce rôle de protection est assuré notamment par la participation de POT1 comme seule protéine de liaison à l'ADN simple brin du complexe Shelterin (de Lange, 2005). Des études ont montré que la délétion du gène POT1 dans des cellules humaines entraîne la dégradation des régions terminales et la fusion des chromosomes (Baumann and Cech, 2001). Ces instabilités chromosomiques induites par la délétion de POT1 peuvent s'expliquer en partie par la non formation de la T-loop (Palm and de Lange, 2008). De même le modèle de liaison de POT1 à l'extension 3' permet le coiage de l'extrémité du chromosome, empêchant la liaison de RPA et par conséquent empêchant l'activation des voies de contrôle telle que la kinase ATR d'accéder à cette extrémité (Lei et al., 2004). Enn la protéine POT1 est également impliquée dans la régulation et le maintien de la longueur des télomères. Des expériences in vitro montrent que POT1 inhibe l'activité de la télomérase à l'extrémité 3' de l'ADN en contrôlant l'accessibilité à son substrat (Lloyd et al., 2016).

La protéine POT1 possède un partenaire au sein de la cellule, à savoir TPP1. Cette protéine a été découverte en 2004 par Liu et al (Liu et al., 2004), nommée à l'origine PTOP. Elle existe sous diérentes appellations : PTOP (Liu et al., 2004), TINT1 (Houghtaling et al., 2004), PIP1 (Ye, 2004) ou encore ACD (Else et al., 2007). TPP1 participe au complexe du Shelterin en assurant la liaison entre POT1 et TIN2 (de Lange, 2005). Une étude montre qu'en l'absence de TIN2, le complexe POT1-TPP1 n'est plus présent aux télomères (Takai et al., 2011). De plus bien qu'aucune interaction de TPP1 avec l'ADN télomérique n'ait été mis en évidence (aucun complexe entre TPP1 et l'ADN n'a été détecté par EMSA), ce dernier améliore l'anité de liaison de POT1 avec son substrat d'un facteur d'environ 10 (Xin et al., 2007; Wang et al., 2007; Taylor et al., 2011). De ce fait TPP1 est essentielle à la présence de POT1 aux télomères. La protéine TPP1 permet le recrutement et améliore la processivité de la télomérase, participant ainsi au maintien de la longueur des télomères (Zhong et al., 2012; Lloyd et al., 2016).

En résumé le complexe POT1-TPP1 joue un rôle crucial dans la protec-tion des télomères grâce à la liaison de POT1 à l'extension 3', empêchant l'activation des voies de contrôle. De plus le complexe POT1-TPP1 régule la longueur des télomères soit, en inhibant l'accès de la télomèrase par séques-tration de son substrat en 3' par POT1, soit, en recrutant la télomérase et

en améliorant sa procéssivité via TPP1. Sa structure

La protéine POT1 est constituée d'une chaine de 634 acides aminés (71 kDa) et se compose de trois domaines OB fold (Figure 1.14). Les domaines OB1 et OB2 situés en N-term sont impliqués dans la liaison à l'ADN télomé-rique. En C-term on trouve un domaine OB3 qui permet l'interaction avec la protéine TPP1. Au centre du domaine OB3 est situé un domaine HJRL (Holliday junction resolvase-like). Des expériences in vitro en présence de POT1 C-term (320 - 634 aa) n'ont pas mis en évidence d'interaction entre le motif HJRL et une séquence d'ADN mimant une jonction Hollidays (Chen et al., 2017) ; cependant ce domaine HJRL est essentiel pour la stabilité de l'interaction de POT1 avec son partenaire TPP1 comme cela a été révélé par cristallographie (Chen et al., 2017; Rice et al., 2017b).

Figure 1.14  Les domaines structuraux et fonctionnels de POT1 La protéine TPP1, composée de 540 acides aminés, est présente sous deux isoformes au sein de la cellule. La présence de ces deux isoformes est induite par un épissage alternatif, dont la région située en N-term correspond à un "exon alternatif" encore peu étudié. La forme majoritaire est celle qui est dépourvue des 86 premiers acides aminés et qui nous intéressera dans la suite de la thèse. TPP1 se compose d'un domaine OB fold en N-term, suivi d'un domaine d'interaction avec POT1, POT1 interaction motif (PIM), et d'un domaine de liaison avec TIN2, TIN2 binding motif (TBM) (Figure 1.15.A). Malgré la présence d'un domaine OB fold, aucune interaction entre l'ADN et TPP1 n'a été observée (Xin et al., 2007; Wang et al., 2007). On remarque la présence d'un motif TEL présent dans le domaine OB fold de TPP1. Ce domaine TEL permet le recrutement de la télomérase par TPP1. Enn il est important de noter que dans le cadre de mes expériences en présence de TPP1, j'ai travaillé avec une version tronquée de la forme majoritaire, à savoir sans le domaine d'interaction avec TIN2 (Figure 1.15.B). Mon travail se limitant à l'étude des protéines de liaison à l'ADN simple brin aux télomères,

le système a été simplié en retirant le domaine d'interaction avec TIN2 (TBM) qui ne participe pas à la liaison du complexe POT1-TPP1 à l'ADN.

Figure 1.15  Les domaines structuraux et fonctionnels de TPP1 .

A. Domaines de TPP1. B. Domaines de TPP1 tronquée.

Il n'existe à ce jour aucune structure à haute résolution de la protéine POT1. En revanche, la structure de POT1 N-term (1 - 300 aa contenant uniquement les domaines OB1 et OB2), en présence de son ligand, à savoir la séquence 5'-TTAGGGTTAG-3' (10 nt), a été résolue en 2004 par cristallo-graphie (Figure 1.16)(Lei et al., 2004). En 2017 deux équipes ont déterminé simultanément par cristallographie la structure de POT1 C-term en interac-tion avec TPP1 (Figure 1.17)((Rice et al., 2017a; Chen et al., 2017)). Ces structures sont composées du domaine OB3/HJRL de POT1 et du domaine d'interaction à POT1 de TPP1 (PIM).

De même que pour POT1, il n'existe aucune structure à haute résolution de TPP1. En revanche, l'équipe de M. Lei a résolu par cristallographie le domaine OB fold de TPP1 (Figure 1.18)(Wang et al., 2007). On peut égale-ment citer que le domaine de TPP1 permettant la liaison à TIN2 (TBM) a été résolu par cristallographie en 2017 (Hu et al., 2017).

La structure du complexe POT1-TPP1 n'est pas connue à ce jour. Ce-pendant une expérience de SAXS (Small Angle X-rays Scattering) réalisée par Chen et al, en 2017 a permis de déterminer l'enveloppement du com-plexe POT1-TPP1 en présence de la séquence minimale de liaison de POT1 : 5'-TTAGGGTTAG-3' (Figure 1.19) (Chen et al., 2017). Ces résultats pré-sentent le complexe POT1-TPP1 sous la forme d'un V allongé, situant TPP1 à l'opposé de POT1 N-term et par conséquent de l'ADN également.

Figure 1.16  Structure cristallographique de POT1 N-term en pré-sence de son ligand d'ADN (PDB : 1XJV).(a.) Carte expérimentale de densité d'électron à 1.73 A. (b.) Représentation du potentiel électrostatique de surface : potentiel positif en bleu, potentiel négatif en rouge. (c.) Diagramme en ruban de POT1 N-term avec son ligand 5'-TTAGGGTTAG-3'. (Lei et al., 2004)

A. B.

Figure 1.17  Structure cristallographique de POT1 C-term en pré-sence de TPP1 .Diagramme en ruban de POT1 C-term en interaction avec TPP1 (A.) (PDB : 5UN7) (Rice et al., 2017a).(B.) Les domaines OB3 et HJRL de POT1 respectivement en jaune et en vert, le domaine PBM de TPP1 en cyan (PDB : 5H65) (Chen et al., 2017).

Figure 1.18  Structure cristallographique du domaine OB fold de TPP1 (PDB : 2I46)Diagramme en ruban du OB fold de TPP1 (Wang et al., 2007)

Figure 1.19  Enveloppe déterminée par SAXS du complexe POT1-TPP1 en présence d'ADN.Trois vues diérentes de l'enveloppe en forme de V du complexe POT1-TPP1 en présence d'ADN, T10 : 5'-TTAGGGTTAG-3'. Docking des structures cristallographique de POT1 N-term (PDB : 1XJV), POT1 C-term en interaction avec TPP1 (PDB : 5H65) et TPP1 OB fold (PDB : 2I46) dans l'enveloppe de SAXS. (Chen et al., 2017)

Son mécanisme de liaison à l'ADN

La protéine POT1 est une protéine OB fold de la catégorie des protéines qui reconnaissent des régions monocaténaires spéciques d'acides nucléiques. En eet des expériences de SELEX, Systematic Evolution of Ligands by EX-ponential enrichment , ont montré que le domaine OB1 reconnaît le motif télomérique humain 5'-TTAGGG-3', alors que le domaine OB2 lie la séquence 5'-TTAG-3' (Choi et al., 2015). Cela implique que la protéine POT1 a pour séquence minimale de liaison : 5'-TTAGGGTTAG-3' (10 nt), séquence que l'on nommera H10. Cette spécicité de séquence de POT1 s'explique en par-tie par la nature des interactions mises en jeu et révélées par la structure cristallographique de Lei et al (Figure 1.16). Parmi les 31 liaisons hydro-gène impliquées, 13 sont spéciques des séquences et impliquent les groupes donneur-accepteur Watson-Crick des bases de l'ADN avec des résidus de la protéine (Figure 1.20) (Lei et al., 2004). Il est intéressant de remarquer que le domaine OB1 comptabilise 22 liaisons hydrogène, c'est-à-dire plus des deux tiers de POT1, suggérant que le site principal de POT1 soit 5'-TTAGGG-3' de OB1. Le domaine OB2 crée neuf liaisons hydrogène avec l'ADN télomé-rique, dont huit avec T7 et G10. A9 est le seul nucléotide du motif de liaison qui ne fait aucune interaction par liaison hydrogène, ce qui suggère que la position 9 ne participe pas à la spécicité de séquence. Le nucléotide à l'extré-mité 3' du motif, G10, est pris dans une poche hydrophobe formée par deux brins β (β3 et β47. De plus la base G10 est en interaction par quatre liaisons hydrogène ce qui semble expliquer la reconnaissance hautement spécique de ce nucléotide. Cette séquestration de la guanine présente en 3' pourrait expliquer le rôle protecteur de POT1 de l'extension simple brin contre la dégradation par les exonucléases. L'interaction de POT1 à son substrat met en jeu un grand nombre d'empilements des bases avec des résidus d'acides aminés aromatiques mais aussi entre bases (Figure 1.20 et 1.21). De plus, les résultats de cristallographie montrent que la liaison des domaines OB1 et OB2 à l'ADN télomérique induit une courbure de l'ADN d'un angle d'environ 90◦ (Figure 1.16).

Figure 1.20  Détail des interactions de chaque nucléotide avec les diérents résidus de POT1(Lei et al., 2004)

Figure 1.21  Schéma de liaison de POT1 à son ligand H10. (Lei et al., 2004)

La présence de TPP1 améliore l'anité de POT1 pour son substrat (Xin et al., 2007; Wang et al., 2007; Taylor et al., 2011), mais également aug-mente considérablement la discrimination de POT1 pour l'ARN

(Nanda-kumar et al., 2009). En eet la récente découverte de l'ARN télomérique TERRA (Azzalin et al., 2007), dont la séquence est constituée de répé-tions (UUAGGG)n, a soulevé la question suivante : comment POT1 se lie dèlement à l'ADN simple brin télomérique et évite la liaison avec l'ARN qui pourrait détourner POT1 des télomères ? La réponse a été apportée par l'équipe de Thomas R. Cech en montrant in vitro qu'en présence de TPP1 la protéine POT1 ne reconnait plus son substrat si on remplace la deuxième thymine du motif de reconnaissance, 5'-TTAGGGTTAG-3', par une uracile, 5'-TUAGGGTTAG-3' (Nandakumar et al., 2009). Cette étude révèle que TPP1 renforce la spécicité de POT1 pour son substrat.