Étude dePOT1 : résultats et discussion

A la suite de l'étude réalisée sur POT1-TPP1, j'ai étudié les mécanismes de liaison de POT1 seule sur ces longues séquences télomériques capables de se structurer en G4 contigus. Pour étudier ces mécanismes j'ai réalisé des expériences d'EMSA en présence des séquences télomériques décrites pré-cédemment à savoir H45, H69 et H93 qui forment en potassium (K+) res-pectivement deux, trois et quatre G4 contigus (Figure 2.6.A). Le résultat montre que POT1 seule est capable de prendre en charge des multimères de G4 en tandem. Á partir des quantications des complexes protéines :ADN, j'ai obtenu des courbes de liaisons (Figure 2.6.B) qui présentent aussi une allure sigmoïdale qui pourrait signier une coopérativité apparente similaire à celle observée avec le complexe POT1-TPP1. Pour m'en assurer, j'ai réalisé des expériences EMSA en présence de lithium (Figure 2.6.C) Les courbes de quantication des complexes POT1-ADN ne présentent plus d'aspect sigmoï-dal (Figure 2.6.D).

Cependant, dans le cas de POT1 et contrairement à ce que nous avons observé avec POT1-TPP1, le nombre de bandes retardées ne correspond pas au nombre de sites de liaison. En eet regardons la liaison de POT1 à la séquence H21. H21 possède deux sites de liaison possibles (TTAGGGTTAG), mais qui sont mutuellement exclusifs (si l'un est occupé, l'autre ne peut pas être occupé) :

* 5'-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' * 5'-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'

Pourtant l'étude en EMSA montre la présence de complexe de st÷chiométrie 1 :1, 2 :1 et même 3 :1 à haute concentration en protéine (Figure 2.7.A). Un résultat similaire a été observé chez S. pombe(Figure 2.7.B) (Dickey and Wuttke, 2014). Ceci suggère que POT1 est capable de se lier de manière partielle à l'ADN télomérique lorsqu'elle est en large excès par rapport à son substrat, montrant que le mode de liaison de POT1 dépend de sa concentra-tion. La structure cristallographique du complexe POT1-ADN, caractérisée par Lei et al. (Lei et al., 2004) montrent que les domaines OB1 et OB2 se lient respectivement la séquence 5'-TTAGGG-3' et 5'-TTAG-3' (Figure 1.16) ; on peut imaginer que POT1 soit capable de se lier par l'intermédiaire du seul domaine OB1, probablement le plus stable, réduisant sa séquence de liaison à 5'-TTAGGG-3'. Cette hypothèse peut expliquer la présence de complexes POT1 :ADN de st÷chiométrie 3 :1. L'hypothèse que OB1 soit le domaine

de la POT1 humaine de plus haute anité pour l'ADN est confortée par les données relatives à la Pot11 de S. pombe : à la diérence de POT1 humaine, les deux domaines OB1 et OB2 de Pot1 (S. pombe) ont pu être produits et donc étudiés séparément ; cela a permis de montrer que, pour Pot1, le do-maine OB1 isolé a une plus forte anité pour l'ADN que le dodo-maine OB2 isolé. Il est possible que, pour des raisons structurales à élucider, la formation du complexe POT1-TPP1 rende impossible la liaison avec l'ADN via le seul domaine OB1 de POT1.

Figure 2.6  Expérience EMSA avec POT1 en présence de longues séquences télomériques. A. EMSA en présence de H45, H69 et H93 en po-tassium. [POT1] : 0 / 50 / 100 / 200 / 400 / 800 / 1400 nM. B. Quantication des expériences EMSA en potassium. C. EMSA en présence de H45, H69 et H93 en lithium. [POT1] : 0 / 50 / 100 / 200 / 400 / 800 / 1400 nM. D. Quantication des expériences EMSA en lithium.

Á ce stade ce mode de liaison de POT1 via le seul domaine OB1 reste hypothétique. Pour conrmer ou inrmer ce modèle des expériences plus ap-profondies sont nécessaires. Nous pouvons notamment imaginer d'utiliser une séquence courte d'ADN télomérique au sein de laquelle les diérentes posi-tions des thymines seraient remplacées par des 4-thioThymines. Par consé-quent nous pourrions ainsi sonder l'environnement de notre ADN et mettre en évidence par photopontage la présence ou non de complexe de diérente st÷chiométrie en fonction de la concentration en POT1. Pour aller encore plus loin, une étude par spectroscopie de masse des complexes ADN

:pro-téine formés pourrait mettre en évidence les acides aminés impliqués dans les diérents mode de liaison et ainsi démontrer la liaison partielle de POT1 par l'intermédiaire d'un de ces domaines OB fold.

A. B.

Figure 2.7  .

Mode de liaison partiel de POT1 en fonction de la concentration chez l'homme et S. pombeA. EMSA en présence d'un H21 en lithium. [POT1] : 0 / 50 / 100 / 200 / 400 / 800 / 1400 nM. B. Pot1 de S. pombe forme un complexe de st÷chiométrie plus élevé visible par EMSA à haute concentration

en présence de 12mer. (Dickey and Wuttke, 2014)

J'ai également réalisé des expériences de FRET an d'étudier la capacité de POT1 à ouvrir un G4 en fonction de sa position au sein de la séquence. Pour ce faire j'ai travaillé avec le même système utilisé dans les expériences de FRET en présence du complexe POT1-TPP1 à savoir un oligonucléotide capable de former trois G4s en tandem auxquelles un couple de uorochrome donneur-accepteur a servi pour marquer chaque G4. Les résultats de FRET montrent que POT1 ouvrent plus ecacement les G4 en position 3' et central que celui en 5' (Figure 2.8). L' unique expérience de cinétique, réalisée avec 6 équivalent de POT1 (Figure 2.9) conrme que POT1 ouvre préférentielle-ment les G4 situés à l'extrémité 3' et au centre, ce qui semble suggérer une directionalité de liaison 3' vers 5' de POT1. Une étude plus approfondie est nécessaire pour le conrmer.

Figure 2.8  Spectre d'émission de POT1 en fonction des G4s si-tués sur la séquence H69.Les courbes correspondent aux quantications du pourcentage d'ouverture en fonction de la concentration : la courbe bleu correspond au G4 à l'extrémité 3', en vert au G4 central et enn en rouge au G4 en 5'.

Figure 2.9  Cinétique d'ouverture par POT1 des G4s situés sur la séquence H69.La courbe bleu correspond au G4 à l'extrémité 3', en vert au G4 central et enn en rouge au G4 en 5'.

En conclusion POT1 seule est capable de se lier et d'ouvrir les struc-tures G4 en tandem formées par de longues séquences télomériques. L'aspect sigmoïdal des courbes de liaisons de POT1 à l'ADN en potassium laisse à imaginer un modèle de coopérativité apparente en présence de G4 conti-gus similaires à celui proposé pour POT1-TPP1. Cependant l'étude de la liaison de POT1 à de longues séquences télomériques est plus complexe à appréhender et à interpréter. Les raisons à cette complexité sont multiples. Nous pouvons rappeler que le mode de liaison de POT1 dépend de la concen-tration et qu'elle est capable d'adopter un mode de liaison partiel à haute concentration. De même les expériences de Hwang et al. en 2012 montrent que deux protéines POT1 sont nécessaires à l'ouverture d'un G4 tandis qu'un seul complexe POT1-TPP1 est susant (Hwang et al., 2012). Ce résultat in-dique qu'il faut donc deux événements de liaison de POT1 pour ouvrir un G4. De plus, une étude réalisée en molécule unique par Ray et al. montre que la protéine POT1 seule peut-être déplacée de son ADN, si ce dernier se restructure en G4 (Annexe 8.5) (Ray et al., 2014). Toutefois, leur étude ne donne pas susamment d'informations sur le mode de liaison de POT1 ou s'il y avait une ou deux protéines POT1 présente sur l'oligonucléotide, un H24 c'est-à-dire deux sites distincts de liaison de POT1. Cependant ce résul-tat nous montre que POT1 seule peut être déplacé de l'oligonucléotide par la simple restructuration d'un G4. En compilant mes données préliminaires sur POT1 et les données de la littérature, je propose le modèle d'interaction de POT1 sur les G4 contigus suivant : une première protéine POT1 vient se lier en 3' de la séquence et ainsi dérouler le G4 à cette extrémité (Figure 2.10). Ensuite il existe deux possibilités :

1 : La vitesse de liaison d'une seconde protéine est plus rapide que la vitesse de reformation du G4. Dans ce cas la liaison de la seconde protéine assure ainsi le maintien de l'ouverture du G4. La présence de ces deux protéines sur l'ADN va déstabiliser le G4 contigu, ce qui va favoriser la xation d'une troisième protéine et ainsi de suite. Dans ce cas de gure, on est dans un mode de liaison séquentiel coopératif apparent de 3' vers 5 décrite en présence de POT1-TPP1.

2 : La vitesse de liaison d'une seconde protéine est moins rapide que la vitesse de reformation du G4. Dans ce cas le G4 se restructure et déplace la protéine POT1.

Á mon avis il y a les deux phénomènes qui ont lieu en même temps dans nos expériences, ce qui pourrait expliquer en partie la complexité de notre système. Sans parler que ce modèle ne prend pas en compte les diérents modes de liaison de POT1 lié à sa concentration. La possibilité qu'un premier évènement de liaison échoue (cas de gure 2) pourrait expliquer en partie la

complexité de l'interaction de POT1 seule avec l'ADN.

Figure 2.10  Modèle de liaison de POT1 sur des longues séquences capables de former des G4s contigus.

Il est important de ne pas voir les complexes POT1-ADN et POT1-TPP1-ADN comme gés mais plutôt dynamiques, ce qui se traduit ici par la "res-piration" des G4s. C'est un aspect qui n'a pas été abordé dans l'article sur POT1-TPP1. Même si aucune expérience ne permet d'armer que le com-plexe POT1-TPP1 résiste mieux à la formation d'un G4, sachant que TPP1 améliore l'anité de POT1 à l'ADN télomérique et qu'un seul complexe POT1-TPP1 sut pour maintenir le G4 ouvert, on peut envisager que TPP1 améliore la vitesse de liaison de POT1 à l'ADN et ainsi la restructuration du G4.

2.4.2 Étude de RPA

L'étude réalisée en 2018 au sein de l'équipe SANTÉ a montré que RPA est capable de prendre en charge des G4s télomériques en tandem et, avec une mode de liaison légèrement coopératif, probablement du, à la lumière des résultats obtenus avec POT1-TPP1, à la présence des G4 contigus (Lancrey et al., 2018). Mes études de cinétique en FRET montrent que RPA ouvre plus facilement le G4 en position centrale que ceux situés aux extrémités. Ce résultat est en accord avec le fait que les G4s aux extrémités sont plus

stables que celui en position centrale (Bugaut and Alberti, 2015) et que RPA lie et ouvre préférentiellement les G4 les moins stables (Ray et al., 2013; Safa et al., 2014). A partir de ces résultats, je propose un mécanisme de liaison et d'ouverture des multimères de G4 contigus par RPA, rendant compte de sa coopérativité : RPA se lie et ouvre tout d'abord le G4 central, et cette liaison entrainerait la déstabilisation des G4s voisins facilitant la liaison d'autres protéines (Figure 2.11).

Il est à noter que la coopérativité observée pour RPA est faible. Cette faible coopérativité pourrait s'expliquer par le fait que RPA présente dié-rents modes de liaison détaillés dans la section 1.5.3. On peut supposer que la protéine RPA se lierait au G4 central dans une "conformation allongée étendue" (30 nt), couvrant la totalité de la séquence impliquée dans la for-mation du G4. Dans cette situation, RPA ne génèrerait pas une région simple brin pouvant favoriser la xation d'une autre protéine RPA. Du moins dans un premier temps, car au contact d'une autre protéine RPA adopterait une conformation plus compacte. Dans cette conformation la protéine RPA liée à l'ADN génère un simple brin et favorise dans cette situation la xation d'une deuxième protéine traduisant une coopérativité.

Figure 2.11  Modèle de la coopérativité de RPA sur des séquences formant des multimères de G4 en tandem.