I.4 La protéine de nucléocapside du VIH-1
La NCp7 est l’une des protéines majeures de l’architecture du cœur du virus. Du fait de son abondance, elle recouvre l’ensemble du génome ARN, permet sa condensation 314-316 et le protège contre les attaques des RNases cellulaires 39-40. On compte environ 1500 à 2000 molécules de NC, avec chaque molécules se liant au maximum à 11-12 nucleotides 317-321. La NCp7 joue un rôle crucial, tant dans les étapes précoces que tardives du cycle viral, telles que l’assemblage des nouvelles particules virales 224, 322-323, l’encapsidation de l’ARNg 63, la dimérisation de l’ARNg
320
, la trancription inverse 209 et l’intégration 324. La NCp7 est une protéine chaperon des acides nucléiques qui déstabilise les structures secondaires des acides nucléiques pour les restructurer en des conformations thermodynamiquement plus stables 177, 209-210, 325. Cette propriété chaperon des acides nucléiques est essentielle au cours de la transcription inverse de l’ARNg 41, par exemple, elle intervient dans le placement de l’ARNtLys3 sur la séquence PBS en tant que domaine de GagPr55 326, elle joue également un rôle dans le premier et le second transfert de brin 33, 140, 177. Les mutations dans la NCp7 réduisent considérablement l’infectiosité virale 327-328 et désigne la NCp7 comme une cible thérapeutique potentielle pour le développement d’une nouvelles classe d’antirétroviraux 48, 140, 329-330.
I.4.1 Genèse
La protéine de nucléocapside est un produit de clivage de la polyprotéine précurseur Pr55 Gag, qui contient quatre domaines majeurs : la matrice (MA), la capside (CA), la nucléocapside (NC) et le domaine p6 avec un domaine NC bordé par deux petits peptides p2 en N-terminal et p1 en C-terminal ou nommés SP1 et SP2 respectivement. La protéine Ncp7 est présente, selon, les phases du cycle de réplication, sous forme intégrée à Gag, sous forme immature (NCp15), intermédiaire (NCp9) ou mature (NCp7), désignées par leurs masses moléculaires respectives (Figure 16A).
54
Figure 16A: Séquences des protéines de nucléocapside du VIH-1. Le premier clivage par la protéase libère la forme immature NCp15 (1-123), puis la forme intermédiaire NCp9 (1-71) et finalement la forme mature NCp7 (1-55). Les lignes représentent les deux sites de clivages par la protéase présents dans la NCp15. La partie N-Terminal est en gris, les deux doigts de zincs en vert, le linker en orange, la partie C-terminal en mauve et enfin p1-p6 en bleu.
Au cours de la maturation de la particule virale, la protéine Précurseur Pr55 Gag va subir une série de clivages, réalisée par la protéase (PR) en des sites bien spécifiques 331 et qui se déroule dans un ordre séquentiel défini (Figure 17A) : Le clivage initial se produit après le peptide p2, les produits résultant de ce clivage sont le domaine p41 (MA, CA, p2) et le domaine p15 (NC, p1, p6) 332. Le domaine p15 (NC, p1, p6) constitue le domaine NC sous forme immature NCp15 qui doit obligatoirement être lié à l’ARNg viral pour subir un second clivage après le peptide p1 333-334, libérant le domaine p6 et aboutissant à une forme intermédiaire, la NCp9 (NC, p1). Un dernier clivage après le domaine NC, libère le domaine p1 et aboutit à la forme mature de la NC nommée NCp7. Quant au domaine p41, il va également subir un processus de maturation, la PR va d’abord cliver après la MA pour aboutir à une MA mature (p17) et un domaine p25 (CA, p2), ce dernier subira un clivage après la CA pour la libérer du petit peptide p2 (Figure 17A). Ainsi, au cours de la maturation, la protéine de nucléocapside existe d’abord sous une forme immature ou intermédiaire NCp15 (123 aa) et NCp9 (71 aa) respectivement avant d’adopter sa forme mature NCp7 (55 aa), forme prédominante dans les particules virales matures
335-336
. Il faut noter que le clivage correctement fait par la protéase permet la maturation de la NC, qui est essentielle pour l’infectivité du VIH-1 336-338. Effectivement, l’assemblage, le bourgeonnement et le clivage protéolytique de Gag et Gag-pol sont des évenements très reliés. Pour ce qui est de la durée des évènements, il semblerait que l’activation de la protéase a lieu plus tard, au cours de l’assemblage, à condition que le clivage soit complet au moment du bourgeonnement
55
ou juste après la libération de la particule virale 339.
Figure 17A: Illustration du clivage protéolytique de la polyprotéine GagPr55 par la PR et l’influence de cela sur la maturation de la particule virale 238.
I.4.2 Structure
La protéine de nucléocapside mature NCp7 est constituée de 55 acides aminés et possède une masse moléculaire de 6430 Da. C’est une protéine qui contient une partie N-terminale fortement basique et deux doigts de zinc (ZF) reliés par une région charnière ou "linker" fortement basique (Figure 18A). Ce linker est fortement conservé et il a été montré que le résidu Pro31 joue un rôle critique dans le rapprochement des doigts de zinc 340-342. Chaque ZF possède un motif conservé CCHC fixant le zinc qui est défini par un arrangement C-X2-C-X4-H-X4-C (C=Cystéine, H=Histidine et X est un acide aminé variable) 343-344. Ces motifs CCHC sont capable de chélater le Zn2+ de manière stœchiométrique et avec une affinité élevée d’environ 10-13 M 345-348. Le cation Zn2+ est coordonné de manière tétraédrique par les groupements thiols des cystéines et aminos de l’histidine 343, 347,
349-350
. La structuration des domaines à doigts de zinc permet la formation de plateaux hydrophobes dans chacun des doigts de zinc : le premier est constitué par
56
les résidus Val13, Phe16, Ile/Thr24 et Ala25 ; le second est constitué par les résidus Trp37, Gln45 et Met46 344, 349, 351. Ce plateau hydrophobe est impliqué de façon essentielle dans la fixation de la NCp7 aux acides nucléiques, via de multiples contacts avec les bases des oligonucléotides, selon des modalités qui seront discutées au chapitre suivant. Il est à noter que la structuration des doigts de zinc est essentielle pour l’activité de la protéine 344, 349 d’auntant plus que la conservation du motif CCHC est très élevée et témoigne donc de son importance biologique. En effet, plusieurs études ont démontré que des mutations au niveau des doigts de zinc avaient des conséquences très négatives sur la réplication virale 177, 351-352.
Figure 18A: Structure secondaire (A) et tertiaire (B) de la protéine de nucléocapside NCp7. Le code couleur est le même que pour la figure (16A) 178.
I.4.3 Propriétés
I.4.3.1 Reconnaissance et modalités de liaisons aux acides nucléiques