Oligonucléotides

Tous les oligonucléotides ont été fournis par Eurogentec (Belgique). Pour les expériences d'anisotropie de fluorescence, la fluorescéine (un marqueur fluorescent) a été greffée à l’extrémité 5’ de ces acides nucléiques (Tableau 1B).

Tableau 1B. Oligonucléotides utilisés pour l’étude par anisotropie de fluorescence. Oligonucléotide Séquence SL3 ADN 5’ F*GGACTAGCGGAGGCTAGTCC 3’ SL3 ARN 5’ F*GGACUAGCGGAGGCUAGUCC 3’ SL3 ADN20G 5’ F*GGACTAGCGGGAGGCTAGTCC 3’ cTAR26 5’ F*CCAGAGAGCTCCCGGGCTCGACCTGG 3’ cTAR33 5’ F*TAGCCAGAGAGCTCCCGGGCTCGACCTGGTCTA 3’ GCG 5’ F*TAGCGAT 3’ GCG11 5’ F*TCTAGCGATCT 3’ GCG13 5’ F*TACTAGCGATCAT 3’ GGC 5’ F*TAGGCAT 3’ TCG 5’ F*TATCGAT 3’ AGC 5’ F*TAAGCAT 3’ TGC 5’ F*TATGCAT 3’ TAC 5’ F*TATACAT 3’ ACG 5’ F*TAACGAT 3’ CCG 5’ F*TACCGAT 3’ GAG 5’ F*TAGAGAT 3’ caGAG 5’ F*CAGAGAC 3’ caGCT 5’ F*CAGCTAC 3’ caGGC 5’ F*CAGGCAC 3’ caUCG 5’ F*CAUCGAC 3’ caTCG 5’ F*CATCGAC 3’ caGCU 5’ F*CAGCUAC 3’ caGUC 5’ F*CAGUCAC 3’ caGTC 5’ F*CAGTCAC 3’ caTGC 5’ F*CATGCAC 3’ caUGC 5’ F*CAUGCAC 3’ atGAG 5’ F*ATGAGAT 3’

Nous avons choisi d’étudier des structures en tige boucle (cTAR26, cTAR33, SL3 ADN20, SL3 ARN20, SL3 ADN20G) (Figure 1B) ainsi que de courtes séquences linéaires incapables de se replier et contenant différentes séquences avec des sites de fixation préférentiels ou non de la NCp7. Le choix de la taille et de la séquence a été réalisé en tenant compte des propriétés connues de reconnaissance des séquences d’acides nucléiques par la NCp7.

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Figure 1B: Séquences d’oligonucléotides en tige boucle utilisées pour l’étude de l’affinité de liaison de la NCp7 aux acides nucléiques. Les structures secondaires ont été prédites par mfold. De gauche à droite, la tige boucle SL3 ADN (20 nt) et son homologue ARN (SL3 ARN), SL3 ADN avec une guanine rajoutée sur sa boucle apicale en position 11 (SL3 ADN20G), les séquences tronquées cTAR ADN (26 nt) et (33 nt).

Pour les expériences de FRET, nous avons étudié l’hybridation entre les séquences TAR et cTAR tronquées (29 nt) afin de simplifier le modèle expérimental et d'étudier correctement les effets de l'inversion des boucles internes dans les molécules. Une tetramethylrhodamine (TMR) a été greffée en 5’ et une fluorescéine a été greffée en 3’ sur les séquences ADN (Tableau 2B). Nous avons tout d’abord réalisé un couple des séquences sauvages nommées TAR0/cTAR0. Un deuxième couple mutant a été réalisé en inversant les positions des boucles internes simple brin (Figure 2B), car ces dernières constituent des sites où la protéine NCp7 se fixe préférentiellement, puis déstabilise les régions adjacentes ⁴¹². Si la NCp7 se fixe puis déstabilise les séquences double brins avec une polarité définie comme nous l'avons exposée dans l’introduction (Figure 19A), la modification de la position des boucles internes devrait influer de façon importante sur le positionnement de la protéine et donc sur la déstabilisation associée. Pour chacune des deux familles de molécules (cTAR0/TAR0) et (cTAR1/TAR1), d’autres types de mutants ont été realisés, le but des expèriences avec ces mutants est de caractériser pour chacune des familles le chemin d'hybridation préféré : "kissing complex" ou "zipper mechanism". Les mutants au niveau des boucles apicales permetttent de tester si le chemin "kissing complex" est affecté tandis que les mutants au niveau des extréméités des tiges rendent plus difficile le passage par le mécanisme "zipper". La comparaison des expèriences effectuées, à l'intérieur de chaque famille, avec les molécules sauvages, les

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mutants "loop" et les mutants "stem" devraient permettre de déduire dans chacun des cas quel est le mécanisme d'hybridation majoritarire.

Les mutants destinés à empêcher l’hybridation via un mécanisme "kissing complex" possèdent deux mutations au niveau des boucles apicales des ADNs ce qui affecte la complémentarité de ces dernières avec leur homologue ARN (cTAR0_29nt_loop et cTAR1_29nt_loop) (Figure 2B).

Pour les mutants "stem" destinés à affecter le chemin "zipper", les mutations (au nombre de deux) se trouvent au niveau des extrémités des ADNs ce qui affecte également la complémentarité de ces dernières avec leur homologue ARN (cTAR0_29nt_stem et cTAR1_29nt_stem) (Figure 2B).

Tableau 2B. Oligonucléotides utilisés pour l’étude par FRET. Oligonucléotide Séquence

TAR0_29nt 5’ ACA GAG UCU GAG CCU GGG AGC UCC UCU GU 3’ cTAR0_29nt 5’ TMR*ACA GAG GAG CTC CCA GGC TCA GAC TCT GT*F 3’ TAR1_29nt 5’ ACA GAG GAG CCU GGG AGC UCU CUC UCU GU 3’

cTAR1_29nt 5’ TMR*ACA GAG AGA GAG CTC CCA GGC TCC TCT GT*F 3’ cTAR0_29nt_stem 5’ TMR*CAA GAG GAG CTC CCA GGC TCA GAC TCT TG*F 3’ cTAR0_29nt_loop 5’ TMR*ACA GAG GAG CTC AAA GGC TCA GAC TCT GT*F 3’ cTAR1_29nt_stem 5’ TMR*CAA GAG AGA GAG CTC CCA GGC TCC TCT TG*F 3’ cTAR1_29nt_loop 5’ TMR*ACA GAG AGA GAG CTC AAA GGC TCC TCT GT*F 3’

Figure 2B: Séquences d’oligonucléotides TAR/cTAR utilisées pour l’étude par FRET. À gauche est représenté le couple sauvage (TAR0 et cTAR0), à droite est représenté le couple mutant (TAR1 et cTAR1) dont la position des boucles internes a été inversé. Les bases encadrées représentent les modifications effectuées sur les ADNs, sur la boucle apicale pour empêcher l’hybridation par les boucles (loop0 et loop1) ou par les extrémités 5’/3’ (stem0 et stem1).

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Pour les expériences de RMN PRE, les heptaoligonucléotides (Tableau 3B) sont modifiés soit en 5’ ou 3’ par une base 4-thio-dT (S4dT) ou 4-thio-U (S4U) pour les ADNs et les ARNs respectivement (Figure 3B). Par la suite, les oligonucléotides seront marqués par un agent paramagnétique, le proxyl. Le protocole de marquage est détaillé au paragraphe chapitre méthodes (III.2.3.3).

Tableau 3B. Oligonucléotides utilisés pour l’étude par RMN PRE.

Oligonucléotide modifié Noms 5’ S4-TAGAGAT 3’ 5’S4T 5’ TAGAGAT-S4 3’ 3’S4T 5’ S4-UAGAGAT 3’ 5’S4U 5’ TAGAGAU-S4 3’ 3’S4U

Oligonucléotide marqué au Proxyl Forme

paramagnétique

Forme

diamagnétique 5’ Proxyl-S4-TAGAGAT 3’ 5’Proxyl-D 5’Ox-D 5’Red-D 5’ TAGAGAT-S4 -Proxyl 3’ 3’ Proxyl-D 5’Ox-D 3’Red-D 5’ Proxyl-S4-UAGAGAU 3’ 5’Proxyl-D 5’Ox-R 5’Red-R 5’ UAGAGAU-S4 -Proxyl 3’ 3’ Proxyl-D 5’Ox-R 3’Red-R

Figure 3B: Sonde paramagnétique et bases modifiées utilisées pour le marquage des oligonucléotides pour l’étude par RMN PRE.