ce qui cause l’ouverture transitoire des extrémités 5′ et 3′ (flèches courtes), par un processus de « fraying » et de « strand stretching ». La fixation de la NCp7 à TAR et cTAR mène à la formation de complexes nucléoproteiques ou les ANs sont entièrement recouverts par les molécules de NCp7, cela mène à l’hybridation rapide des séquences complémentaires ce qui aboutit à la formation d’un hybride ADN :ARN 224.
I.4.3.3.1 Déstabilisation des structures secondaires des acides nucléiques
La capacité de déstabilisation des acides nucléiques par la NCp7 est médiée par ces deux doigts de zincs, dépend fortement de la stabilité des acides nucléiques, de la présence de motifs tels que des "bulges", des boucles apicales, des mis-appariements ainsi que des paires de bases terminales 178, 412.
L'un des modèles proposés est afin de déstabiliser les structures secondaires des acides nucléiques, la NCp7 progresse le long des brins des acides nucléiques en se fixant sur les régions simples brins, puis en déstabilisant les paires de bases adjacentes. Cela permet aux régions simples brins précédemment "séquestrées" dans les régions doubles brins de devenir accessibles et de s'apparier avec des séquences complémentaires situées sur d'autres molécules (Figure 23A). Ce mode d’action, très schématique et non démontré, permettrait une propagation de la déstabilisation tout en permettant un glissement de la NCp7 ou la fixation d’autres molécules de NCp7 178.
Figure 23A: Mécanisme schématique de la déstabilisation d'une séquence repliée d'acide nucléique par la NCp7. La protéine (vert) se fixe premièrement sur la région simple brin et déstabilise ensuite la région double brin voisine pour pouvoir se fixer aux nucléotides exposés, c’est ainsi qu’elle va permettre l’appariement des séquences complémentaires 413.
Le mode de fixation "polarisée" de la NCp7 le long des chaines d'acides nucléique tel que nous l'avions décrit au paragraphe (I.4.3.1.3), devrait aussi conditionner la localisation des zones double brin qui vont être déstabilisées par la NCp7 et donc « piloter » tout le mécanisme de déstabilisation des structures repliées.
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En effet la fixation de la NCp7 au niveau d’une région simple brin va positionner, dans le cas des ARNs, le domaine ZF1 impliqué dans la déstabilisation à proximité des séquences double brin situées en 3’ de cette région simple brin, ce seront donc les zones double brin situées en 3’ des boucles internes qui seront déstabilisées initialement et non celles situées en 5’, la déstabilisation est « polarisée » (Figure 24A).
Figure 24A: Schéma descriptif du mode de déstabilisation d’une séquence ARN double brin située à proximité d’une boucle interne. Dans un complexe NCp7:ARN, Le ZF2 est d’avantage impliqué dans la fixation aux régions simple brin et le ZF1 dans la déstabilisation.
De façon frappante, de tels "patterns" de déstabilisation ont été observés dans l’analyse des régions double brin déstabilisées par la NCp7 dans l’ensemble du génome. Dans la région 5’ UTR du virus, qui comporte le plus de régions déstabilisées par la NCp7, les séquences déstabilisées sont toujours situées en 3’ des boucles internes simple-brin 264. La polarité de fixation de la NCp7 le long des acides nucléiques permet aussi de mieux comprendre le processus de redistribution de la NCp7 des brins ARN aux brins ADN lors de la transcription inverse 414.
La compréhension du mode d’action de la NCp7 pour procéder à la déstabilisation des structures secondaires est cruciale à l’obtention d’une meilleure compréhension des transferts de brins. Exemple, au cours du premier transfert de brin, l’étape initiale est reliée à la déstabilisation des structures secondaires de la séquence TAR et de son ADN complémentaire cTAR suite à leur liaison à la NCp7 209, 355-356.
Il a été démontré que la NCp7 active l’ouverture transitoire des paires de bases terminales de l’ADN cTAR (Figure 25A) ce qui mène à un "melting" partiel des terminaisons de cTAR jusqu’au bulge T40 ou au mésappariement C.A44 402, 415, cette ouverture reste imparfaite car elle demande obligatoirement la présence de son complémentaire TAR ARN pour optimiser cette déstabilisation 416. Ceci indique également que la déstabilisation de cTAR et l’hybridation avec son complémentaire sont étroitement liées.
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Figure 25A: Modèle illustrant le mécanisme de déstabilisation de cTAR ADN par la NCp7. Les peptides sont représentés par des rectangles. Les rectangles gris correspondent aux premiers peptides qui se lient à cTAR. 1) En conséquence au « fraying », les extrémités terminales des cTAR sont transitoirement présentes en séquence simple brin. 2) Vu que la NCp7 à une préférence pour les séquences simple-brin, les extrémités sb de cTAR vont constituer le site initial de fixation de la NCp7. 3) À partir de là, la NCp7 va déstabiliser les paires de bases adjacentes, permettant le glissement de la protéine et la fixation coopérative de peptides additionnels. 4) En conséquence à la stabilité limitée de la tige de cTAR, le melting va alors se propager jusqu’au misappariement 10C.A44 ou au bulge T40. À ce moment, il est probable que la stabilité brins double-brin restant peut être assez élevée pour prévenir le « melting » complet de cTAR. En conséquence, il y aurait une compétition entre l’extension du melting (5’) et la restructuration des séquences ouvertes (5 et 6) 402.
Il est également important de souligner l’importance des deux doigts de zinc qui confèrent justement à la protéine son activité de déstabilisation 358, ceci a été confirmé avec des mutants de NCp7 ne possédant pas de motifs à doigts de zinc (NC(13-61)dd) ou ne présentant pas de structuration ((SSHS)2NC(1-55) où toutes les Cystéines ont été remplacées par des Sérines pour prévenir la fixation du zinc). En effet, ces derniers ont failli à déstabiliser la structure secondaire de la séquence cTAR, le peptide (SSHS)2NC (1-55) a été inapte à altérer la coopérativité de la transition helix coil des molécules d’ADN λ 358 et a eu des effets limités sur l’inhibition du « self priming » de cTAR 383. D’autre part, la mutation du Trp37 par une Leu a des conséquences dramatiques sur la fixation et la déstabilisation de cTAR, avec une perte de la fixation de l’ARNtLys3 à la séquence PBS, ce qui bloque l’initiation de la transcription inverse 383. La nécessité de la présence de deux doigts de zinc bien structurés ainsi que du Trp37 au sein du second ZF suggère l’importance du plateau hydrophobe dans le processus de déstabilisation 383.
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stabilité de l’oligonucléotide. Par exemple, la déstabilisation par la NCp7 est plus efficace pour la séquence cTAR ADN que pour son homologue ARN qui est plus stable 402, 404. D’ailleurs une stabilisation des parties basses de cTAR a démontré la difficulté de la NCp7 à déstabiliser cTAR ainsi qu’à bloquer le "self priming" de l’ADN strong stop 417. On en conclut, que le "melting" des tiges de cTAR est dù à la présence de bulges terminaux, ce qui aide la NCp7 à déstabiliser cTAR 402.
Dans le cas du second transfert de brin, la NCp7 promeut l’hybridation entre les séquences complémentaires PBS (+) et PBS (-), ce mécanisme est dépendant de la déstabilisation des tiges de PBS 418. Il a également pu être montré que la fixation de la NCp7 à la séquence 5-CTG-7 de PBS (-), induit une "présentation" des bases présentes dans la boucle apicale ainsi qu'une déstabilisation de la paire C5-G11 adjacente à la boucle 365, Cet ensemble d'événements favorise le mécanisme d’hybridation du type "kissing complexe" (interaction boucle-boucle) entre les séquences PBS complémentaires (+) et (-) 419.