Discussion

En conclusion, les expériences de FRET ont démontré que les cinétiques d'hybridation du couple sauvage cTAR0-TAR0 s’avère être plus rapide que celles du couple mutant cTAR1-TAR1. Au-delà de ces différences quantitatives, ce qui nous apparaît le plus intéressant est que l'inversion de la position des boucles entraîne un changement dans la voie d'hybridation majoritaire. Pour les deux couples de molécules (le couple sauvage et le couple mutant), les hybridations se produisent par les deux chemins (c'est ce que montrent les expériences avec les mutants du type "loop" et "stem").

Pour le couple sauvage le chemin d'hybridation par les extrémités ("zipper") apparait être le chemin majoritaire tandis que pour le couple mutant, c'est le chemin d'hybridation initié par les complexes boucle-boucle ("kissing complex") qui est majoritaire.

L'utilisation pour chaque couple des molécules appelées "stem" et "loop" permet d'identifier les chemins majoritaires utilisés dans chaque cas. De telles conclusions ne peuvent être tirées, évidemment, que si les résultats des expériences réalisées sur chacun des couples sont bien cohérents entre eux. Par exemple pour le couple sauvage, on constate que l'altération de la tige (molécule "stem" avec laquelle on perturbe l'association par les extrémités sans perturber la formation des complexes boucles-boucles) ralentit les cinétiques d'hybridation (ou plus précisément les valeurs k2), tandis que l'altération de la boucle (molécule "loop0", cette modification de deux paires de bases dans les boucles

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apicales perturbe l'association boucle-boucle sans modifier les possibilités d'association par les extrémités) augmente les cinétiques d'hybridation. Ce dernier comportement est possible si on considère que du fait de la perturbation du chemin "loop", un plus grand nombre de molécules (que dans le couple sauvage) emprunte le chemin d'hybridation "zipper" favorisé thermodynamiquement dans le cas du couple sauvage. L'ensemble de ces trois expériences (couple sauvage et expériences avec "stem0" et "loop0") est donc compatible avec l'hypothèse de l'existence de deux chemins coexistants mais avec un chemin privilégié qui est le chemin "zipper" dans le cas des molécules sauvages.

De façon frappante, les molécules mutantes (c'est à dire TAR1 et cTAR1 avec les boucles internes inversées) montrent des comportements opposés. Le couple mutant "stem1" favorise les hybridations par rapport au couple initial TAR1-cTAR1, tandis que le couple mutant "loop1" montre que l'hybridation avec TAR1-cTAR1 est très ralentie. L'ensemble des résultats des trois types d'expériences sur le couple mutant est donc cohérent mais montre que si, de la même façon que pour les molécules sauvages, les deux chemins d'hybridation sont présents, c'est ici le chemin "kissing complex" qui est majoritaire.

En présence de concentration saturante de NCp7 (à partir de 1:15 NC d'après Vo et al, 2009) avec les molécules TAR-cTAR entières (59nt), il est connu que TAR-cTAR emprunte une voie ‘zipper’, ce qui est en accord avec nos résultats pour notre couple sauvage. Cependant, il apparait que le changement de position des boucles internes fait basculer le mécanisme d’hybridation vers un mécanisme de type "kissing complex" et cela même en présence de concentration saturante de NCp7 (puisque l'on travaille à des rapports 1:5). De tels résultats sont compatibles avec les hypothèses suivantes : (i) nous avons remarqué, comme mentionné dans l'introduction (Figure 20A), des modes de fixation différents de la NCp7 sur les ADNs et les ARNs (ceci a été établi sur la base de la comparaison des complexes NC:acides nucléiques existants ³⁶². (ii) le mode de fixation précédent induit un positionnement de ZF1 (le domaine de la NCp7 le plus impliqué dans la déstabilisation des structures secondaires) particulier par rapport aux paires de bases d'une structure tige-boucle (Figure 5 de l’article 1, diagrammes B et C).

En partant des hypothèses faites ci-dessus, avec les séquences sauvages, la NCp7 déstabilisera d'abord les tiges apicales tandis qu'avec les séquences mutantes ce sont les tiges basses qui seront déstabilisées en priorité. Les tiges apicales sont bien celles qui sont majoritairement présentes dans les complexes de type "zipper" tandis que les tiges basses sont majoritairement présentes dans le cas des complexes de type "kissing complex".

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présence de la NCp7 par gel retard a confirmé que la protéine est essentielle pour une hybridation efficace des deux partenaires et qu’en absence de la NCp7, la réaction s’avère être très lente. Cela indique que la déstabilisation des séquences TAR et cTAR est une étape limitante pour permettre leur hybridation et que la présence d’une protéine avec une activité chaperon est nécessaire pour leur permettre d’aboutir à un duplex étendu et stable. De plus, on observe que la NCp7 améliore l’efficacité de l’hybridation et ceci même à des concentrations aussi faibles de 1 NCp7 par oligonucléotide (1:59), ce qui n’avait pas été démontré auparavant.

Finalement, nos données soulignent l’importance de l’activité déstabilisatrice de la NCp7 pour l’hybridation de séquences complémentaires qui requiert leur déstabilisation. La NCp7 s’avère être importante pour la formation du duplex partiellement hybridé, ce qui est cohérent avec les résultats de Vo et al., 2009, qui ont déterminé que la NCp7 stabilise ce duplex initial, dont la conversion en duplex étendu est également très dépéndante de la NCp7, étape qui requiert des concentrations plus importantes de protéine ^{406, 420, 424-425}. Par ailleurs, des études antérieures ont démontré que la déstabilisation de TAR ARN par la NC(12-55) est moins efficace que pour cTAR ADN ^{383, 404, 415}. Nous avons entrepris l’étude de la déstabilisation de la structure secondaire de TAR ARN à un faible ratio de protéine par nucléotide (1 NCp7 :59 nt), ces bas rapports étant choisis principalement pour ne pas avoir des élargissements de résonances trop importants. Dans nos conditions, il en ressort qu’une déstabilisation efficace sur la tige boucle s'est avérée que pour seulement trois paires de bases consécutives. En comparant avec les résultats de Bernacchi et al., 2002, bien que leur ratio fût plus élevé (1 NC :7.5 nt) une seule pb a été déstabilisé sur TAR ARN, cependant, la NC(1-55) utilisée dans notre étude a une plus grande activité déstabilisatrice que la NC(12-55) ^{177, 424, 560}. En revanche, nos résultats sont très similaires à ceux obtenus avec une étude réalisée avec des expériences de "single-molecule stretching”, où les auteurs ont analysé la déstabilisation de TAR ARN par la NCp7 ³¹². Cette dernière a démontré, comme nous, que les sites spécifiques ciblés par la NCp7 correspondent aux guanines adjacentes aux régions simple brin de la tige, tel que les "mésappariements", les boucles et les "bulges". Tout comme dans notre étude, la base G26 a été identifiée comme un site clé pour l’initiation de la déstabilisation de la tige boucle TAR ARN. Dans notre étude nous avons choisi d’étudier le complexe à faible ratio dans le but de détecter le site initial par lequel la déstabilisation commence. Nous avons vérifié que l’hybridation TAR-cTAR était accélérée par la NCp7 même dans des conditions de faible ratio. Bien que ces conditions soient évidemment très différentes de celles observées in vivo ³⁵³, elles nous ont permis d'identifier les sites "initiaux" de la

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déstabilisation de TAR ARN et de vérifier que même à faible ratio la NCp7 accélère l'hybridation des partenaires TAR-cTAR. Enfin ces conditions très particulières nous ont permis de mesurer correctement les constantes de vitesses k2, ce qui n'était pas possible ou très difficile lorsqu'on travaille à des rapports NC:nt trop élevés ⁴²⁴.

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IV.2 Etude des propriétés d’interaction de la NCp7 avec des acides