La protéine mCherry-RevErbα

Cette partie est consacrée à l’optimisation des paramètres de transfection du plasmide mCherry-RevErbα. Il est important de transfecter suffisamment de plasmides pour permettre la bonne expression de la protéine d’intérêt. Cependant, par définition la quantité de plasmides transfectée n’est pas dépendante de celle des protéines exprimées. En effet, toutes les séquences codant pour les protéines sont sous la dépendance d’un promoteur fort (SV40) signifiant que dès lors que le plasmide pénètre dans la cellule, la protéine sera exprimée en grande quantité. De ce fait, le plasmide ne doit pas être transfecté en trop grande quantité, afin d’éviter une surexpression voire l’agrégation des protéines, mais il doit tout de même être présent en quantité suffisante afin d’obtenir une expression correcte des protéines et une détection de photons satisfaisante. Il est donc nécessaire de combiner ces deux paramètres essentiels pour optimiser l’expression des protéines : la quantité de plasmides transfectés et le temps de transfection. Certaines protéines, pour s’exprimer, ne nécessitent que quelques heures alors que le protocole de transfection utilisé ici (FuGene) préconise de laisser agir le milieu de transfection 24 heures et d’utiliser 1 µg de plasmide. Des

88 gammes de quantité de plasmides transfectés ainsi que différents temps de transfection ont été essayés. Nous avons estimé dans un premier temps qu’il fallait diminuer la quantité de plasmides, nous avons donc testé une gamme de 0.5 à 1 µg avec des pas de 0.1 µg. Cependant, ces valeurs n’étaient pas suffisamment importantes pour permettre une expression optimale des protéines, trop peu de noyaux exprimaient les protéines et leur concentration trop faible ne permettait pas de collecter les photons nécessaires. Les valeurs de brillances étaient trop petites également, par conséquent, aucune corrélation croisée ne pouvait être obtenue. En revanche une quantité de plasmide transfectée supérieure à 1µg était trop importante et aboutissait à l’obtention de brillances trop élevées car les protéines étaient trop exprimées et donc trop concentrées, proche de 2 µg des phénomènes d’agrégation pouvaient être observés. Nous avons donc choisi pour l’expression nucléaire de la protéine mCherry-RevErbα de transfecter une quantité de plasmide de 1µg. Simultanément à cette étude, différents temps de transfection ont été testés, il a été choisi de laisser agir le milieu de transfection entre 2 et 24 heures en retirant toutes les heures ce milieu. Des temps inférieurs à 12h ne sont pas suffisants pour obtenir une expression correcte des protéines, il a été estimé que le milieu de transfection devait être en contact avec les cellules entre 16 et 17 heures. Une incubation supérieure à 17 heures entraîne des dommages aux cellules importants perturbant leur analyse en microscopie. Ce point a longtemps été débattu sachant que plus le temps de transfection est important et plus les cellules sont abîmées. Le but étant de les imager au plus proche de leur état naturel, il était nécessaire de limiter au maximum les dommages qui leur sont causés que ce soit par le temps de transfection, la quantité de plasmide transfectée ou encore les produits chimiques utilisés pour la transfection.

A présent que les paramètres de transfection pour la protéine mCherry-RevErbα ont été déterminés, il faut mettre au point les conditions d’observation microscopique. Pour commencer il était nécessaire de déterminer le temps de résidence par pixels (TRP ou pixel dwell time) optimal pour l’observation et la détection de la protéine mCherry-RevErbα. Idéalement, ce TRP doit être adapté au mouvement de la protéine, afin d’être suffisamment rapide pour que la particule fluorescente soit immobile à l’échelle de temps de l’échantillonnage. En clair, il faut se placer en haut de la courbe d’autocorrélation (Figure 4.2).

Figure 4.2 : Courbe d’autocorrélation illustrant l’intervalle de temps permettant de choisir le TRP approprié à notre étude. Les courbes ont été réalisées avec le couple de récepteur nucléaire mCherry-Tif2 et

Cerulean-ERα.

Un TRP bien choisi permet d’améliorer les brillances moléculaires obtenues qui reposent sur le mouvement brownien des particules entrant et sortant du volume d’excitation. Il ne faut pas que durant le TRP les molécules aient le temps de traverser ce volume d’excitation et ainsi moyenner le signal. C’est ainsi qu’un TRP de 32 microsecondes a été sélectionné comme étant optimal pour

89 l’observation des protéines d’intérêts. Suite à cela, des noyaux de cellules Cos7, exprimant la protéine mCherry-RevErbα seule, ont été imagés afin de vérifier que les photons émis spécifiquement par la mCherry sont détectés exclusivement dans le canal 1 et non dans le 2. La réception dans le canal 2 de ce signal de fluorescence fausserait la réattribution des signaux et l’interprétation de la corrélation croisée entre les 2 FPs. Dans un premier temps, l’expression de cette protéine a été détectée comme exclusivement nucléaire (Figure 4.3). Bien que le récepteur nucléaire soit rapporté comme pouvant exister en faible quantité dans le cytoplasme, nous la trouvons exclusivement nucléaire dans la majorité des cas (probablement parce que les cellules sont imagées une à deux heures après avoir retiré le milieu de transfection). La vraie brillance (e) de la mCherry est de 0.036. Ensuite les photons détectés dans chacun des 2 canaux sont analysés. Conformément à ce qui est attendu, le signal d’émission est récupéré uniquement dans le canal 1 pour la mCherry et en effet les photons provenant de cette FP sont tous localisés dans le noyau (Figure 4.3).

Figure 4.3 : Représentation du traitement de la totalité du noyau imagé : 50 µm par 50 µm, 256 pixels par 256 pixels. Les FPs sont excitées par un laser biphotonique à une longueur d’onde de 950 nm et une puissance de 36 mW avec un TRP de 32 microsecondes. Canal 1 et canal 2 : Le nuage de points représente

l’intensité de fluorescence en fonction de la brillance dans le canal 1 (mCherry) ou dans le canal 2 (Cerulean) de chaque pixel. Ces derniers sont reportés sur la carte de correspondance des pixels dans la

cellule où chacun est réattribué à une position précise dans la totalité de la cellule imagée. Les histogrammes des brillances représentent la répartition des valeurs obtenues ainsi que leur fréquence pour

tous les pixels de l’image (comprenant également les particules péri-nucléaire). La corrélation croisée représente les valeurs de Bcc en fonction des brillances (B1 ou B2), et chaque pixel est réattribué dans la

cellule imagée.

En revanche, aucun signal n’est détecté dans le noyau de la cellule dans le canal 2, le signal récupéré provient de structures situées à l’extérieur du noyau (Figure 4.3). En effet, lorsqu’une région d’intérêt spécifique (ROI) à l’intérieur du noyau est sélectionnée et analysée, aucun signal fluorescent, qu’il provienne de la mCherry ou de la Cerulean, n’est détecté dans le canal 2 signifiant donc que l’émission de la mCherry est récupérée uniquement dans le canal 1 (Figure 4.4). Les

90 structures très intenses, trouvées à l’extérieur du noyau, donnent une brillance (B) supérieure à 2 prouvant qu’ils peuvent être des agrégats ou plus probablement des débris cellulaires dûs à la transfection (Figure 4.4). D’ailleurs, ces particules sont retrouvées dans les deux canaux avec des covariances énormes. Ces vésicules péri nucléaires pourraient subir des phénomènes non-linéaires, car aucune entité fluorescente bleue n’est présente dans ces cellules. Ce signal n’est donc pas spécifique à la protéine d’intérêt mais pourrait aboutir à la détection d’une forte corrélation croisée au vu de la grande valeur de brillance. Il est donc important lors de l’analyse de ne pas prendre en compte ces éléments très brillants. L’utilisation d’une ROI (Region of Interest) qui sélectionne une zone à l’intérieur du noyau uniquement (Figure 4.4) permet de s’affranchir de ces particules et d’analyser uniquement le signal provenant spécifiquement des protéines d’intérêt nucléaire. La valeur de brillance de la mCherry est alors diminuée à 0.01, puisque les agrégats ne participent plus au calcul de la brillance dans ce cas-là. La corrélation croisée est inexistante comme indiqué dans la figure 4.2 lorsque seul mCherry-RevErbα est exprimée. Puisqu’aucun signal n’est détecté dans le noyau dans le canal 2, aucune covariance ne peut être observée (Figure 4.4).

Figure 4.4 : Représentation du traitement d’une zone d’intérêt sélectionnée spécifiquement à l’intérieur du noyau (ROI). Les FPs sont excitées par un laser biphotonique à une longueur d’onde de 950 nm et une puissance de 36 mW avec un TRP de 32 microsecondes. La ROI (carré blanc) sert à isoler cette zone et à calculer les brillances et les Bcc uniquement à l’intérieur de celle-ci. Canal 1 et canal 2 : Le nuage de points représente l’intensité de fluorescence en fonction de la brillance dans le canal 1 (mCherry) ou dans le canal 2 (Cerulean) de chaque pixel. Ces derniers sont reportés sur la carte de correspondance des pixels dans la

cellule où chacun est réattribué à une position précise dans la ROI. Les histogrammes des brillances représentent la répartition des valeurs obtenues ainsi que leur fréquence pour tous les pixels contenus dans la ROI. La corrélation croisée représente les valeurs de Bcc en fonction des brillances (B1 ou B2), et

chaque pixel est réattribué dans la ROI.

Cette protéine est donc satisfaisante de par le fait qu’excitée à 950 nm avec un TRP de 32 microsecondes elle est détectée uniquement dans le canal 1 et non dans le 2. La protéine Cerulean-NCor peut désormais être étudiée afin de déterminer les conditions optimales d’observation.

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