CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
II. LE COMPLEXE REVERBΑ / NCOR
3) Mécanisme d’action du complexe répresseur RevErbα / NCor-HDAC3
a) Interaction RevErbα / NCor
La liaison entre les récepteurs nucléaires et leurs corégulateurs est un sujet largement étudié. La boîte NR est la surface d’interaction des récepteurs nucléaires avec les coactivateurs. Chaque boîte NR présente un motif commun : LxxLL nécessaire et suffisant à la liaison des NRs (Heery et al, 1997). La surface d’interaction des corégulateurs (CoAs ou CoRs) est similaire de par leur séquences de liaison aux récepteurs nucléaires, mais suffisamment distincte pour permettre au ligand de fonctionner comme un commutateur. La spécificité d’interaction des corépresseurs avec les récepteurs nucléaires est déterminée individuellement par les interactions spécifiques de ces derniers avec les domaines IDs des CoRs. La partie responsable de l’interaction à l’intérieur des IDs
16 est appelée motif CoRNR (CoRepressor Nuclear Receptor) (Hu and Lazar 1999). Les corépresseurs SMRT et NCor possèdent 2 CoRNRs :
Le CoRNR1 (motif IxxII dans l’ID1)
Le CoRNR2 (motif LxxII dans l’ID2) (Figure 1.11) (Seol et al, 1996).
Figure 1.11 : Alignement des séquences d'acides aminés des domaines ID1 et ID2 des 2 corépresseurs NCor et SMRT humains. Les domaines ID1 et ID2 contiennent les motifs CoRNR 1 et 2 dont le motif I/LxxII est hautement conservé. Les résidus hydrophobes conservés sont représentés en gras (Hu and Lazar 1999).
Ces motifs sont hautement conservés chez tous les corépresseurs, de la même manière que la boîte NR est préservée chez les coactivateurs. De façon générale, les récepteurs présentent différentes affinités pour l’ID1 ou l’ID2 (Hu and Lazar 2001). La préférence des NRs pour NCor ou SMRT est due à des différences dans l’ID1, mais pas dans l’ID2. La haute spécificité des interactions des récepteurs nucléaires avec les corépresseurs suggèrent que la répression est régulée par la validité des combinaisons : récepteur-CoRNR-CoR. Il a effectivement été révélé que RevErbα interagit exclusivement avec le CoRNR1, mais pas avec le CoRNR2. D’autre part, le peptide CoRNR2 de NCor et SMRT interagit sans distinction avec les récepteurs nucléaires. En effet, seuls 14 acides aminés (2274-2287) de l’ID2 de NCor sont suffisants pour son interaction avec différents NRs. Ces 14 acides aminés sont hautement conservés entre NCor et SMRT avec seulement 2 acides aminés de différence, suggérant que l’ID2 ne médie pas la spécificité de liaison du CoR avec les NRs (Hu and Lazar 2001). Ces domaines d’interaction des corépresseurs (ID) ont été étudiés en détails, c’est ainsi qu’en 2000, un troisième domaine ID3 a été identifié uniquement dans NCor et pas dans SMRT.
Le motif commun à tous les CoRNR (I/LxxII) est retrouvé dans cette séquence de NCor (Figure 1.10) (Webb et al, 2000). Une recherche a ensuite été menée pour vérifier si les 3 motifs CoRNR (ID1, ID2 et ID3) sont nécessaires à la fixation de RevErbα. Une mutation des ID2 et / ou ID3 n’abolit pas la liaison entre RevErbα et NCor mais entraîne une baisse d’affinité (Kim et al, 2010). En revanche, il a été démontré par FRET3 et par double hybride qu’une ou des mutations dans le domaine ID1 (en dehors du motif CoRNR) diminue très fortement l’interaction entre les 2 protéines. Mais une mutation d’un des résidus isoleucine du CoRNR1 (IxxII) abolit complètement cette interaction et entraîne également la perte de l’inhibition de la transcription (Phelan et al, 2010).
Afin de tester l’importance de certains domaines dans RevErbα pour son interaction avec NCor, de nouveaux tests en double hybride ont été réalisés. Il apparaît que le LBD de RevErbα (région E) est nécessaire à son interaction avec NCor. L’absence de ce domaine abolit effectivement la liaison du récepteur nucléaire avec le corépresseur (Downes et al, 1996). Il a par la suite été tenté de délimiter le domaine d’interaction spécifique à l’intérieur du LBD. Mais les essais n’ont pas été concluants suggérant que le LBD entier est nécessaire pour l’interaction du RN avec NCor. Des ChIPs suivies de gels retards ont également précisés que la stœchiométrie de fixation du complexe sur l'ADN est de 2 molécules de RevErbα pour une molécule de NCor (Zamir et al, 1997).
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Le FRET (Fröster Resonance Energy Transfer) permet de détecter la proximité de deux molécules et donc de visualiser directement leur interaction par un transfert d'énergie de fluorescence.
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b) Cristallisation du domaine de liaison au ligand de RevErbα avec le
peptide ID1 de NCor
La cristallisation de RevErbα associé à NCor a nécessité de nombreuses années. La purification de la protéine RevErbα entière est assez compliquée puisqu’elle présente une faible solubilité. La protéine NCor quant à elle est très grosse et le complexe entier des 2 protéines pleine taille est impossible à obtenir. Cependant, en 2010, la structure du domaine de liaison au ligand de RevErbα associé au peptide ID1 de NCor est publiée. Le LBD pleine taille de RevErbα (281-614) ayant des problèmes de solubilité, une délétion a été effectuée : 281-614 Δ324-422. La perte du domaine riche en proline entre les hélices α1 et α3 a permis de purifier cette partie du récepteur. Ce mutant du LBD de RevErbα a été cristallisé avec le peptide NCor ID1 (2045-2065) (Figure 1.12 A).
Malgré la délétion et l’absence d’hélice H12, la structure globale du domaine de liaison au ligand de RevErbα est semblable à tous les autres LBD des récepteurs nucléaires. Il est juste composé de 11 hélices au lieu de 12, et forme un feuillet beta anti parallèle avec le peptide NCor ID1. Ce feuillet beta établit un nouveau réseau moléculaire permettant à la partie C-ter de RevErbα de s’associer avec la partie N-ter du peptide corépresseur NCor. C’est un feuillet beta classique établissant des liaisons hydrogènes avec ses partenaires et finissant par la liaison entre l’Isoleucine 2049 de NCor avec la Leucine 607 de RevErbα. Le haut degré de stabilité atteint par le peptide NCor ID1 lié à RevErbα est reflété par le fait que la structure de 21 résidus du peptide NCor est très bien définie. Le peptide NCor ID1 lié à RevErbα adopte une structure en hélices α qui se lie co-axialement dans l’espace traditionnellement réservé à la fixation d’un coactivateur ou à l’hélice α12 du domaine AF2 dans un récepteur nucléaire activé (Figure 1.12 B). De plus, le peptide NCor ID1 est stabilisé dans le sillon hydrophobe du LBD de RevErbα par un repositionnement de l'hélice H3 de ce dernier. De ce fait, la liaison du peptide au récepteur est protégée et stabilisée. Tout ceci mène à dire que, bien que les structures au sein des RNs soient différentes, en particulier RevErbα, le mécanisme d'action reste le même et les RNs agissent de la même manière lors de la fixation d'un corépresseur (Phelan et al, 2010). Afin de bien comprendre le fonctionnement exclusivement répresseur de transcription de ce complexe, il est nécessaire de prêter attention à la formation du feuillet beta antiparallèle. Des travaux réalisés sur l'association du récepteur nucléaire RARα avec les corépresseurs NCor et SMRT ont révélé que l'activité basale répressive du RN est conféré par un brin beta qui forme un feuillet beta antiparallèle avec des résidus spécifique du domaine ID1 de NCor ou SMRT. La liaison d'un ligand agoniste induit la transition du brin beta en hélice α permettant la formation de l'hélice H11 qui provoque la relâche du corépresseur et le repositionnement de l'hélice H12 entraînant le recrutement du coactivateur (Le Maire et al, 2010). Ce même principe s'applique au complexe RevErbα / NCor, l'ID1 du corépresseur forme un feuillet beta antiparallèle avec l'hélice H11 ce qui permet la stabilisation du complexe. Cependant, même en absence de fixation de NCor et de la formation de l'hélice α H11, l'absence de l'hélice H12 ne permettra pas le recrutement d'un coactivateur. Le récepteur nucléaire RevErbα ne sera donc jamais activateur de transcription.
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Figure 1.12 : (A) Structure cristalline du complexe LBD de RevErbα (281-614 Δ324-422) avec le peptide NCor ID1 (2045-2065). RevErbα est représenté en violet alors que NCor est en bleu et vert. La formation du
feuillet beta est bien représentée, sa formation stabilise le complexe et confère une partie de l’activité répressive de la transcription des gènes cibles. (B) Vue rapprochée de l'interaction entre les hélices H3 et
H4 de RevErbα et le motif CoRNR1 de NCor. La partie bleue représente la zone hautement conservée et nécessaire à l'interaction, les résidus isoleucine indispensable à l’interaction des 2 protéines sont
représentés en rouge (Phelan et al, 2010).
Cette structure (Figure 1.12) confirme le fait que ce complexe est un répresseur constitutif de la transcription. A présent que ces protéines ainsi que leur mode de liaison et d’action sont bien déterminées, il est important de connaître exactement les gènes qu’elles régulent. Ce complexe est actif dans de nombreuses régulations métaboliques. Le complexe répresseur RevErbα / NCor est en fait un des acteurs majeurs de la maintenance du rythme circadien.