Protéine Cerulean-NCor

Cette partie est consacrée à l’étude de la protéine Cerulean-NCor pleine taille dans des noyaux de cellules Cos7 et a été réalisée en parallèle des optimisations faites dans la partie précédente sur la protéine mCherry-RevErbα. Le but est de déterminer les conditions de transfection optimale du plasmide afin d’obtenir une expression des protéines satisfaisantes qui donneront des valeurs de brillances adéquates pour l’observation de la corrélation croisée. D’autre part, c’est également le moyen de confirmer que l’utilisation de la FP Cerulean est adaptée à cette étude. Tout comme il a été déterminé que le signal de la mCherry est détecté uniquement dans le canal 1, il est nécessaire de vérifier que les photons émis par la Cerulean seront spécifiquement détectés dans le canal 2 et non dans le 1. Avec le grand pied de bande du spectre d’émission de la Cerulean vers le rouge, ce type de chevauchement spectral à la détection est plus probable que celui du rouge dans le canal bleu et les filtres doivent être bien choisis afin d’éliminer ce phénomène. Nous avons choisi d’utiliser les filtres suivants afin de nous affranchir au maximum des photons provenant de la partie rouge de la bande d’émission de la Cerulean :

 Un filtre 580/LP (pour Long Pass) permet de séparer les photons d’émission. Tous les photons supérieurs à 580 nm (correspondant à la mCherry) sont envoyés sur le détecteur 1. Les pho-tons inférieurs à 580 nm (Cerulean) sont envoyés sur le détecteur 2 (Figure 4.5).

 Un filtre 650/100 permet de récupérer le signal d'émission de la FP mCherry qui possède son pic d'émission à 610 nm (Figure 4.5).

 Un filtre 510/84 permet de récupérer le signal d'émission de la FP Cerulean qui possède son pic d'émission à 475 nm (Figure 4.5).

Figure 4.5 : Illustration des filtres d'émission utilisés afin de maximiser la collecte des photons d’émission en fonction des protéines fluorescentes utilisées : mCherry et Cerulean. Les spectres d'excitation des deux

FPs sont représentés en pointillés. Les spectres d’émission sont colorés en bleu pour la Cerulean et en orange pour la mCherry. La visualisation des filtres directement sur leurs spectres d'émission, indique bien

qu'un maximum de la fluorescence d'émission est collectée

Dans un premier temps, différentes quantités de plasmides ont été transfectées permettant de déterminer rapidement qu’une quantité inférieure à 1 µg n’est pas suffisante pour obtenir une expression optimale des protéines. En effet, l’observation des cellules après une transfection de moins de 1 µg de plasmides révèle que les noyaux ne sont presque pas transfectés. Suite à cela, nous avons essayé des quantités de 1, 1.5, 2, 2.5 et 3 µg, sachant que le corépresseur NCor est une protéine de taille importante (270 kDa) son expression efficace, nécessitant plus de temps que celle de RevErbα, requiert une quantité de plasmides transfectés plus importante afin de maximiser l’expression. A l’issue de cette étude, il a été décidé d’utiliser 2 µg de plasmide Cerulean-NCor à transfecter. Les paramètres d’observation restent inchangés puisque les protéines sont étudiées et excitées de manière simultanée à 950 nm avec un TRP de 32 microsecondes. Il est vrai qu’une excitation à 930 nm aurait été plus adaptée à l’étude de la Cerulean, malheureusement, l’utilisation

92 de cette longueur d’onde ne permettait pas une excitation satisfaisante de la mCherry. Une longueur d’onde de 950 nm est le compromis idéal pour l’observation simultanée de 2 FPs. C’est ainsi que la protéine Cerulean-NCor a été exprimée dans des noyaux de cellules Cos7. Contrairement au récepteur nucléaire qui peut être, en faible partie, retrouvé dans le cytoplasme, le corépresseur NCor est exclusivement nucléaire. Le signal émis provient donc exclusivement de la Cerulean et est uniquement détecté dans le canal 2 (Figure 4.6). La valeur moyenne des vraies brillances (e), qui est de 0.16, démontre que la protéine n’est pas agrégée car elle est nettement inférieure à 1. D’autre part, le signal émis est détecté exclusivement dans le canal 2 et non dans le 1 prouvant donc que cette FP est adaptée à l’étude en cours (Figure 4.6). En effet, aucun signal, spécifique de la protéine d’intérêt, ne sera détecté dans le mauvais canal, de ce fait la corrélation croisée positive qui sera observée sera le reflet de l’interaction entre les 2 protéines.

Figure 4.6 : Représentation du traitement de la totalité du noyau imagé : 50 µm par 50 µm, 256 pixels par 256 pixels. Les FPs sont excitées par un laser biphotonique à une longueur d’onde de 950 nm et une puissance de 36 mW avec un TRP de 32 microsecondes. Canal 1 et canal 2 : Le nuage de points représente

l’intensité de fluorescence en fonction de la brillance dans le canal 1 (mCherry) ou dans le canal 2 (Cerulean) de chaque pixel. Ces derniers sont reportés sur la carte de correspondance des pixels dans la

cellule où chacun est réattribué à une position précise dans la cellule imagée. Les histogrammes des brillances représentent la répartition des valeurs obtenues ainsi que leur fréquence pour tous les pixels de l’image (comprenant également les particules péri-nucléaire). La corrélation croisée représente les valeurs de Bcc en fonction des brillances (B1 ou B2), et chaque pixel est réattribué dans la totalité de la cellule

imagée

Cependant, il est important d’analyser uniquement le signal à l’intérieur du noyau et non celui à l’extérieur. En effet, des particules très brillantes sont retrouvées dans les 2 canaux. Comme précédemment, elles pourraient correspondre à des agrégats (car leur vraie brillance est supérieure à 1), des vésicules péri-nucléaires ou à des débris cellulaires dûes à la transfection. Ces particules sont localisées à l’extérieur du noyau et peuvent être facilement exclues de l’analyse par l’utilisation d’une ROI dans le noyau qui sélectionne une région d’intérêt spécifique (Figure 4.7). La valeur de vraie

93 brillance (e) est alors abaissée à 0.094, sans la contribution d’agrégats dans le calcul, ce qui reste positif et correct comme valeur. La corrélation croisée est inexistante comme indiqué dans la figure 4.7, en effet, l’intensité de fluorescence dans le canal 1 est nulle donc la valeur de Bcc est nulle à l’intérieur du noyau, dans la zone sélectionnée (ROI).

Figure 4.7 : Représentation du traitement d’une zone sélectionnée spécifiquement à l’intérieur du noyau (ROI). Les FPs sont excitées par un laser biphotonique à une longueur d’onde de 950 nm et une puissance de 36 mW avec un TRP de 32 microsecondes. La ROI (carré blanc) sert à isoler cette zone et à calculer les brillances(B1 et B2) et Bcc uniquement à l’intérieur de celle-ci. Canal 1 et canal 2 : Le nuage de points représente l’intensité de fluorescence en fonction de la brillance dans le canal 1 (mCherry) ou dans le canal

2 (Cerulean) de chaque pixel. Ces derniers sont reportés sur la carte de correspondance des pixels dans la cellule où chacun est réattribué à une position précise dans la ROI. Les histogrammes des brillances représentent la répartition des valeurs obtenues ainsi que leur fréquence pour tous les pixels de la ROI. La

corrélation croisée représente les valeurs de Bcc en fonction des brillances (B1 ou B2), et chaque pixel est réattribué dans la ROI.

L’utilisation de la Cerulean est adaptée à l’étude qui nous intéresse, son émission spécifique dans le canal 2 ainsi que les valeurs de vraies brillances (e) de 0.094 obtenues à une longueur d’onde d’excitation de 950 nm en font un partenaire idéal pour la mCherry. En effet, leur excitation simultanée permettra l’identification spécifique d’une interaction entre les protéines pleine taille RevErbα et NCor de par le fait que leurs brillances seront adaptées à la détermination d’une corrélation croisée positive. Afin de vérifier que l’interaction pourra effectivement être détectée, une protéine exclusivement nucléaire (NLS) marquée simultanément en N et C-ter respectivement par la mCherry et la Cerulean servira de contrôle positif.

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