Propriétés enzymatiques des protéines TIP49 in vitro

1) Activités ATPase et hélicase des protéines TIP49 purifiées

Les activités d’hydrolyse d’ATP et de déroulement de molécules d’acide nucléique des protéines TIP49 in vitro sont très largement controversées dans la littérature.

En effet alors qu’une première étude biochimique révèle une absence d’activité ATPase et hélicase avec la protéine de levure yTIP49a (Qiu et al., 1998), l’équipe de Tamura a mis en évidence pour les protéines purifiées de mammifère (Kanemaki et al., 1999; Makino et al., 1999), une activité ATPase induite spécifiquement par de l’ADN simple-brin, et une activité hélicase opposée sur des substrats dérivés de ssM13 (activité hélicase 3’-5’ pour rTIP49a contre 5’-3’ pour hTIP49b). Dans ces premières études, l’état oligomérique des protéines utilisées n’a pas été déterminée.

Plus tard, l’équipe de Nakatani ne réussit à détecter qu’une faible activité ATPase pour les protéines humaines et uniquement dans un complexe de 500kDa contenant les deux protéines TIP49 (kcat = 0,5 ATP min-1). Les auteurs ne détectent par contre aucune activité

hélicase pour les deux protéines seules (dimère pour hTIP49b et monomère pour hTIP49a) ou complexées (Ikura et al., 2000).

Plus récemment, trois études se sont concentrées sur l’analyse biochimique des formes en anneau des protéines TIP49. Tout d’abord, une étude réalisée sur la forme hexamérique de la protéine hTIP49a n’a révélé aucune activité ATPase et hélicase (Matias et al., 2006). L’équipe de Tsaneva a reconstitué un dodécamère contenant les deux protéines humaines hTIP49a et hTIP49b (Puri et al., 2007). Ce complexe possède une faible activité ATPase non stimulée par la présence d’acide nucléique (kcat = 0,7 ATP min-1). Une dernière étude sur les

protéines de levure (Gribun et al., 2008) a mis en évidence une faible activité ATPase pour les deux protéines yTIP49a et yTIP49b non stimulée par la présence d’acide nucléique (kcat = 2

ATP min-1 et kcat = 1 ATP min-1 pour yTIP49a et yTIP49b respectivement). Les auteurs ont

reconstitué par ailleurs un hétérohexamère contenant les deux protéines yTIP49a et yTIP49b, ce complexe possède une activité ATPase spécifiquement induite par la présence d’ADN double-brin linéarisé contenant une extrémité simple-brin (kcat = 5 ATP min-1). Ce travail a

Figure 23 : Alignement de séquence et structure tridimensionnelle des protéines yTIP49a et RuvB. (A) Les séquences des protéines yTIP49a et RuvB de Thermotoga maritima ont été alignées par superposition des structures tridimensionnelles. Les éléments

structuraux représentés en vert sont communs aux deux protéines yTIP49a et RuvB. La numérotation des structures secondaires pour yTIP49a a été choisie de façon a préserver la numérotation adoptée pour RuvB. Les acides aminés composant le domaine DI ont été représentés en bleu. Les résidus conservés impliqués dans la liaison et l’hydrolyse du nucléotide sont colorés en rouge. (B) Structure du monomère de yTIP49a mettant en évidence les trois domaines DI, DII et DIII. La molécule d’ADP est représentée, chaque atome est symbolisée par une sphère (Carbone, Azote, Oxygène et Phosphate colorés en gris, bleu, rouge et vert respectivement). (C) Structure du monomère de RuvB de T. maritima mettant en évidence le découpage en trois domaines. En (B) et (C), les domaines équivalents entre les deux protéines yTIP49a et RuvB sont représentés de la même couleur.

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uniquement lorsque celles-ci sont assemblées en hétérohexamère (activité hélicase 5’-3’).

2) Structure tridimensionnelle de la protéine hTIP49a

La seule protéine TIP49 dont la structure a été résolue, est la protéine humaine hTIP49a. Le cristal révèle un arrangement en anneau hexamérique à l’intérieur duquel chaque monomère est lié à une molécule d’ADP.

(a)

La structure d’un monomère se découpe en 3 domaines, DI, DII et DIII. Le domaine DI (représenté en jaune Figure 23B) contient les acides aminés 1-120 et 296-365, le domaine DII (en bleu Figure 23B) les acides aminés 121-295 et le domaine DIII (en rouge Figure 23), les acides aminés 366-456.

Les deux domaines I et III de la protéine hTIP49a forment un module de type AAA+ dans lequel le domaine I contient les boîtes de Walker A et B, le senseur 1 et le doigt arginine (Figure 23A). Ce domaine est l’homologue structural du domaine N-terminal de RuvB (représenté en bleu Figure 17B, appelé domaine D1, Figure 23C). Le domaine III, qui contient le senseur 2, est l’homologue structural du domaine central de RuvB (représenté en jaune Figure 17B, appelé domaine DI1, Figure 23C).

Le domaine DII est spécifique des protéines TIP49. L’arrangement tridimensionnel des 7 feuillets # qui constituent ce domaine, est semblable aux domaines de liaison à l’ADN de plusieurs protéines impliquées dans le métabolisme de l’ADN tel que la protéine eucaryote hautement conservée RPA (« replication protein A »). La structure de la protéine RPA (Bochkarev et al., 1997) est composée de deux domaines de structure similaire comportant chacun 7 feuillets #. La conservation structurale du domaine DII de la protéine hTIP49a avec la protéine RPA, ainsi que les données biochimiques mettant en évidence la capacité du domaine DII de hTIP49a à lier un ADN simple-brin et double-brin (Matias et al., 2006), font de ce domaine spécifique des protéines TIP49, un nouveau domaine de liaison à un acide nucléique.

(b)

Le cristal comporte trois monomères structuralement non-équivalents (de type A, B et C) qui s’assemblent en anneau hexamérique pour former deux types d’hexamères. Le premier

Figure 24 : Structure de l’hexamère de type A de yTIP49a. (A) Vue de côté (B) Vue d’en haut. Deux monomères adjacents sont représentés en gris et or. Un monomère est représenté avec le même code couleur que la Figure 23B. Les molécules d’ADP sont représentés comme sur la Figure 23B.

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type d’hexamère est formé par la répétition de six monomères de type A et possède une symétrie d’ordre 6 (hexamère représenté Figure 24). Le second type d’hexamère est formé par la répétition de trois dimères de type BC, et se caractérise par une symétrie d’ordre 3. La différence entre les trois types de monomères se fait par la position du domaine DII relativement aux domaines DI et DIII. En effet, le domaine DII est relié au domaine DI via deux feuillets # étendus (Figure 23B), ce qui lui confère une grande flexibilité de mouvement par rapport aux modules AAA+ formé par les domaines DI et DIII.

La forme globale de l’hexamère montre une organisation en deux parties, de façon similaire à ce qui a été décrit pour la protéine bactérienne RuvB (Figure 17C et D). Un anneau de petit diamètre formé par les 6 modules AAA+ (domaines DI et DIII) et un anneau de diamètre supérieur formé par les domaines DII. L’interaction entre les monomères se fait uniquement entre les domaines DI et DIII, c’est-à-dire au sein du petit anneau. Le canal central formé par l’hexamérisation, d’un diamètre de 17Å, ne peut accommoder qu’un ADN simple-brin. La surface interne de ce canal est par ailleurs largement chargée négativement. Ceci a déjà été observé pour l’ATPase hexamérique P4 du bactériophage !12 (Mancini et al., 2004) ou la protéine RepA (Niedenzu et al., 2001), deux enzymes qui lient spécifiquement de l’acide nucléique simple-brin. À l’inverse, lorsqu’une hélicase hexamérique possède un canal central suffisamment large pour recevoir un ADN double-brin, celui-ci est chargé positivement (c’est le cas pour SV40, Figure 13-2D et pour hTIP49b, Figure 30E).

La structure du complexe hTIP49a-ADP révèle par ailleurs que l’hexamérisation bloque la poche de liaison au nucléotide, ce qui rend impossible l’échange d’une molécule d’ADP par une molécule d’ATP. Cette observation peut expliquer l’absence d’activité hélicase décrite pour les formes en anneau des protéines TIP49 (Gribun et al., 2008; Matias et al., 2006; Puri et al., 2007).