Polarité des enzymes SF

(a)

L’ensemble des membres de la famille SF2 caractérisés a une polarité de type A (3’- 5’) à l’exception des membres de la sous-famille XPD, seuls exemples d’enzyme SF2B. Les membres de cette famille (qui incluent la protéine d’archée XPD, les protéines eucaryotes XPD/Rad3, FancJ, RTel1 et Chl1) interviennent dans les mécanismes de réparation par excision-resynthèse de nucléotides. Ce mécanisme de réparation permet de corriger les modifications de l’ADN à l’origine d’une distorsion de la double-hélice, comme des adduits de cisplatine ou des photoproduits engendrés par les rayons UV qui bloquent la réplication de l’ADN et la transcription.

Les hélicases de la famille XPD sont caractérisées par un domaine de liaison au souffre et au fer (domaine FeS), contenant 4 résidus cystéine très conservés, situé à l’intérieur du module « RecA-like » N-terminal (Figure 9A). Bien qu’il ne soit retrouvé dans aucune

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autre famille d’hélicase, le domaine FeS est essentiel à l’activité hélicase des enzymes XPD (Rudolf et al., 2006).

La structure des protéines de la famille XPD a été résolue très récemment grâce à deux études cristallographiques réalisées sur des protéines d’archæ (Fan et al., 2008; Liu et al., 2008). La structure de la protéine XPD montre qu’elle est composée de quatre domaines (Figures 9B et C), deux modules « RecA-like » associés à deux domaines additionnels, le domaine FeS et le domaine arche (en référence à sa forme).

Les deux domaines arche et FeS sont insérés entre deux feuillets " centraux du module « RecA-like » N-terminal, les rendant étroitement connectés à celui-ci. Par opposition, ces deux domaines sont relativement indépendants du module « RecA-like » C-Terminal (Fan et al., 2008).

La structure de la protéine XPD, déterminée en absence d’acide nucléique, montre que le noyau catalytique de cette protéine se superpose parfaitement avec le noyau catalytique des hélicases SF2A NS3 et Hel308 (dont la structure a été obtenue en présence d’acide nucléique) (Buttner et al., 2007; Kim et al., 1998). Cette superposition permet de modéliser le chemin emprunté par l’ADN au sein de la protéine XPD (Liu et al., 2008). La partie duplex du substrat ADN est située sur la gauche du module « RecA-like » C-terminal de l’hélicase Hel308. Étant donnée la polarité opposée des deux protéines Hel308 et XPD, cette modélisation prédit que la partie du duplex du substrat déroulé se retrouve du côté opposé sur la protéine XPD, c’est-à-dire au niveau du domaine N-terminal (Figure 9E). Cette prédiction est en accord avec l’implication du domaine FeS dans la séparation physique des deux brins d’un ADN duplex (Pugh et al., 2008; Rudolf et al., 2006). L’ADN simple-brin ainsi déroulé passerait à travers un canal entre les domaines FeS, arche et le module « RecA-like » N- terminal, puis sur la face supérieure du module « RecA-like » C-terminal, dans la même orientation que celle décrite pour les protéines Hel308 et NS3. Ce canal chargé positivement par des résidus basiques ne peut contenir qu’un ADN monocaténaire (Figure D).

En conclusion, bien que ces deux études structurales soient réalisées en absence d’acide nucléique, la position des domaines FeS et arche suggère fortement que l’ADN simple-brin soit lié dans la même orientation pour les enzymes SF2A et SF2B. Ceci implique que la différence de polarité est la conséquence d’une translocation opposée et non pas d’un chargement opposé de l’enzyme sur l’acide nucléique.

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de définir une polarité puisque la direction de translocation dépend du chargement de l’enzyme sur son substrat. Cependant, des études cinétiques sur des substrats présentant des modifications ou des discontinuités sur l’un des deux brins du duplex, permettent de résoudre ce problème (Stanley et al., 2006). Comme cela a été rapporté plus haut, de telles expériences, associées à des données structurales, ont mis en évidence une fonction prépondérante pour un des deux brins. Ces observations permettent d’unifier pour les moteurs protéiques simple-brin et double-brin, les notions de polarité de translocation (de type ! ou de type ").

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Les ARN hélicases de la famille DEAD catalysent de façon non-processive des réactions de déroulement d’acide nucléique dans les deux sens (Cordin et al., 2006). Cette absence de polarité est atypique comparée aux autres hélicases SF2 ou aux hélicases appartenant aux autres superfamilles. Ces caractéristiques biochimiques sont difficilement conciliables avec les deux modèles de translocation le long d’un ADN simple-brin (modèle chenille et modèle brownien). En effet, ces deux modèles supposent un mécanisme de translocation qui soit à la fois processif et polarisé (voir plus haut).

Cependant une combinaison élégante de données biochimique, structurale et fonctionnelle, réalisée récemment sur l’ARN hélicase à boîte DEAD de drosophile VASA, a permis d’élucider un modèle mécanistique pour ces protéines. Dans ce travail, la structure de la protéine VASA a été résolue complexée à un ARN simple-brin et à un analogue de l’ATP (Sengoku et al., 2006). Dans ce complexe en conformation fermée, la structure révèle un important encombrement stérique entre l’ARN lié et l’hélice !7 du module « RecA-like » N- terminal. Cet encombrement stérique induit une forte courbure de l’ARN entre les nucléotides U5 et U6 qui rend impossible un appariement de bases continu.

Les auteurs proposent ainsi un nouveau modèle mécanistique pour les hélicases ARN de la famille DEAD. Dans ce modèle, le déroulement d’un acide nucléique double-brin se fait par déstabilisation des paires de base en opposition aux deux modèles chenille et brownien. Les deux modules « RecA-like », qui sont dans une conformation très dynamique en absence de cofacteur, lient de manière coopérative l’ATP et un brin de la région duplex. Ces liaisons induisent une courbure sur le brin d’ARN lié, se traduisant par la séparation de quelques paires de bases du côté 5’ ou 3’ par rapport à la courbure, selon leur stabilité relative. Après la liaison à l’ARN et sa courbure, la protéine hydrolyse l’ATP et se détache transitoirement du duplex partiellement déroulé. Une fois désorganisé après un premier cycle d’hydrolyse du

Figure 10 : Mécanisme de déroulement d’une fourche de réplication par la protéine RecG. Le domaine accessoire qui sert de « cale » est représenté en vert, le module RecA-like N-terminal en jaune et le module RecA-like C-terminal en mauve. Les brins matrices (notés « template arm ») sont représentés en bleu et gris. Les brins néosynthétisés sont représentés en jaune (pour le brin tardif ou discontinu noté « lagging arm ») et rouge (pour le brin précoce ou continu noté « leading arm »). Notez l’apparition d’une structure à quatre branches similaires aux jonctions de Holliday (notée « chicken foot »). Pour plus de détails sur le mécanisme moléculaire, voir dans le texte.

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cofacteur, le duplex devient très instable et beaucoup plus sensible à une séparation complète des brins.

Cependant, un nombre de plus en plus important de travaux a mis en évidence in vitro une stimulation des activités enzymatiques des ARN hélicases à boîte DEAD par certains partenaires protéiques. Cette activation peut se traduire entre autre par une augmentation de la processivité de ces protéines (Silverman et al., 2003).