A)
Question posée et démarches expérimentales
Comme nous l’avons montré dans l’article précédent, la taille de l’ADN duplex des substrats utilisés jouent un rôle important dans l’efficacité de l’enzyme à dérouler un ADN duplex. Ceci suggère que TIP49b déroule de manière active un duplex d’ADN. En effet, ce mécanisme suppose une interaction provisoire entre l’enzyme et la partie duplex du substrat à dérouler. Ce processus a été clairement mis en évidence pour la protéine UvrD (Lee and Yang, 2006) grâce aux données structurales obtenues pour cette protéine complexée à un ADN contenant à la fois une partie monocaténaire et une partie duplex (Figure 5). Cette observation, ajoutée au fait qu’un ADN simple-brin de 30 nucléotides est nécessaire pour l’assemblage de hTIP49b en molécule active, prédit que ces fonctions biologiques soient régulées au niveau de sa capacité à lier de l’ADN. La présence d’autres protéines capables de lier les substrats ADN in vivo de TIP49b pourrait ainsi fortement affecter son activité hélicase.
Les substrats chromatiniens sont des compétiteurs potentiels forts. En effet, la protéine TIP49b est connue pour interagir avec plusieurs complexes de remodelage de la chromatine, impliqués à la fois dans la réparation des CDB et la régulation transcriptionnelle. Nous suggérons que ces interactions soient étroitement coordonnées avec l’activation de TIP49b dont l’activité hélicase est probablement inhibée par la structure d’un nucléosome. Plusieurs modifications post-traductionnelles des histones peuvent moduler les interactions entre le nucléosome et l’ADN (Henikoff, 2008) et, par conséquent, affecter l’activité des enzymes impliqués dans le métabolisme de l’ADN dans un contexte chromatinien. Ces notions sont nécessairement spéculatives et difficiles à adresser expérimentalement. C’est pourquoi, nous avons choisi d’étudier cette question dans un système simplifié pouvant servir de concept.
La queue N-terminale de l’histone H3 se projette à l’extérieur de la partie globulaire du nucléosome, des deux côtés de l’axe central de celui-ci entre les deux superhélices de l’ADN (Figure 25), où elles peuvent interagir de manière préférentielle avec l’ADN « linker » (Angelov et al., 2001; Luger et al., 1997). Il y a de nombreux sites de modifications post-traductionnelles impliquées dans la régulation de l’accessibilité à la chromatine et par conséquent, à l’ADN qui y est compacté. Aussi, nous avons considéré un modèle simple mais
Figure 26 : Differential effects of H3 histone-tail modifications on TIP49b DNA unwinding. (A) H3 N-terminal tail-derived peptides used in this study. Positions of modified lysines are indicated in bold. The C-terminal-most lysine was added during synthesis for linkage to biotin (Bio) and is absent in the native sequence. (B) Peptides (0.5 mg) were analyzed by SDS PAGE on a 4-20% Tris-glycine gel followed by silver staining. Molecular- weight marker: Mark12™ (Invitrogen). (C) Time courses of unwinding reactions performed with 1 nM of 3'-5' helicase substrate containing 3' 94-nt ss-tail (ss94ds21), 100 nM of TIP49b and 1 mM of the indicated peptides. (D) Quantification of the time courses. Green circles and line: unwinding reaction by TIP49b in the absence of peptides; black, red, blue and brown: unwinding in the presence of non-modified H3, H3me2/2, H3ac3 and H3me2/2ac3 N- terminal tails, respectively. (E) H3 and H3me2/2 block TIP49b-dependent DNA unwinding (see also Supplementary Figure S6 for individual reactions and quantifications). The helicase substrates were ss94ds21 (ds/ss ratio 0.4), ss30ds21 (ds/ss ratio 1.4) and ss30ds45 (ds/ss ratio 3.0).
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représentatif pour aborder la régulation de l’activité de la protéine hTIP49b dans un contexte chromatinien.
B)
Matériels et méthodes
Les tests hélicases ont été réalisés comme cela a été décrits dans l’article précédent.
C)
Résultats et discussions
Notre étude s’est concentrée sur les 28 acides aminés de la région N-terminale de l’histone H3 qui porte plusieurs lysines conservées, qui sont des substrats d’acétylation et/ou de méthylation in vivo (Figures 26A et B). Le peptide codant pour ces 28 acides aminées (1
µM) ou un peptide contenant une de ces modifications a été incubé dans le mélange de réaction contenant le substrat hélicase 3’-5’ ss94ds21 (voir article précédent, Figure 3A) à 1 nM, la protéine hTIP49b (100 nM) et de l’ATP (1 mM).
La cinétique de déroulement révèle que ces peptides affectent de façon différente l’efficacité de déroulement de l’ADN par TIP49b selon son état de modification (Figure 26C). Le peptide H3 non-modifié et celui contenant les lysines diméthylées aux positions 4 et 9 (H3me2/2) baissent significativement l’efficacité globale de la réaction (Figures 26C et D). À l’inverse, les peptides H3 triacétylés (H3ac3) n’ont aucun effet sur l’activité hélicase de TIP49b. De manière importante, ces effets sont corrélés aux propriétés de liaison à l’ADN simple-brin et double-brin de ces peptides (Figure 27A). En effet, les peptides H3 et H3me2/2 lient de manière efficace de l’ADN simple-brin et double-brin. Ces deux peptides peuvent donc agir en inhibant le chargement initial de TIP49b sur l’ADN simple-brin, et /ou en inhibant l’interaction transitoire avec la partie duplex du substrat, qui est requise pour un déroulement actif de l’ADN. En accord avec cette hypothèse, le peptide triacétylé (H3ac3) et le peptide portant les deux modifications diméthyl et triacétyl (H3me2/2ac3) lient de manière beaucoup moins efficace l’ADN simple-brin et double-brin, et n’ont pas d’effet significatif sur l’activité hélicase de TIP49b sur un substrat ss94ds21. Notez, que l’activité ATPase de hTIP49b n’est pas significativement affectée par les peptides (Figure 27B).
Les effets de ces peptides ont été ensuite étudiés sur des substrats hélicases contenant des régions duplex de différentes longueurs. Les réactions ont été réalisées comme en Figure 5B de l’article précédent et les résultats obtenus sont résumés Figure 26E (voir également les cinétiques individuelles Figure 28). De façon attendue, en présence des peptides H3 et
Figure 27. DNA binding by H3-derived peptides and ATP hydrolysis by TIP49b in the presence of peptides. (A) DNA binding by H3- derived peptides. Single- (ss115, lane 1-7) or double- stranded (ds115, lane 8-14)
probes (1 nM) were
incubated with the peptides shown and analyzed by gel electrophoresis on 8% native polyacrylamide gels using 1xTBE as running buffer. Peptide concentrations were 0.2 (lanes 1, 8), 0.5 (lanes 2, 9), 1 (lanes 3, 10), 2 (lanes 4, 11), 5 (lanes 5, 12), 10 (lanes 6, 13) and 20 (lanes 7, 14)
µM. While not quantitative, these results illustrate the qualitative differences in the effects of the peptides tested. (B) ATP hydrolysis by TIP49b is not significantly affected in the presence of H3-derived peptides. ATPase activity of TIP49b (0.89 µM) was measured in the absence or in the presence of peptides (1 µM) as indicated. Time courses of ATP hydrolysis in the presence of ssM13 (10 ng/µl) and ATP (200 µM) were measured in five independent experiments. The values were 2.3 ± 0.3, 2.1 ± 0.4, 2.4 ± 0.5, 2.7 ± 0.4 and 2.74 ± 0.4 µM ADP/min (mean ± SE, N = 5) for TIP49b alone or in the presence of unmodified H3, H3me2/2, H3ac3 and H3me2/2ac3, respectively.
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H3me2/2, une augmentation de la taille de la partie double-brin supérieure à 45 paires de bases résultent en une inhibition drastique de l’activité hélicase de hTIP49b. En accord avec l’hypothèse que les modifications des queues d’histone jouent un rôle important dans la modulation de l’activité de hTIP49b dans un contexte chromatinien, les peptides H3ac3 et H3me2/2ac3 relèvent cette inhibition. L’ensemble de ces résultats illustre comment des modifications post-traductionnelles de queue d’histone peuvent réguler via leur propriété de liaison à l’ADN, l’activité enzymatique de hTIP49b, le peptide H3 représentant ici un exemple représentatif, mais nécessairement limité.
Notez que ces données sont en accord avec les travaux de l’équipe de Baek réalisé sur la régulation de l’expression du gène suppresseur de tumeur métastatique kai1 (Kim et al., 2005). Les auteurs ont montré que dans des cellules normales, l’interleukine IL-1! active l’expression de ce gène en induisant le recrutement de TIP49a et de l’acétylase TIP60, ce qui traduit par une acétylation des histones H3 et H4 au niveau du promoteur. À l’inverse, dans des cellules métastatiques, les protéines TIP49a et TIP60 sont remplacées par TIP49b et la déacétylase HDAC1, ce qui induit une hypoacétylation de la chromatine maintenant le promoteur de kai1 à l’état réprimé.
Un rôle putatif des modifications post-traductionnelles des histones dans la régulation de l’activité de hTIP49b est appuyé par les résultats d’immunoprécipitation présentés plus bas. Ensemble, ces données suggèrent que les protéines TIP49 pourraient d’une part intervenir dans le recrutement des enzymes de modifications post-traductionnelles des histones et d’autres parts, répondre par une activité hélicase (et donc un remodelage de la chromatine) de manière spécifique à ces modifications.