Les hélicases SF1B

Les enzymes de cette famille les plus connues sont l’hélicase bactérienne RecD et l’hélicase du bactériophage T4 Dda. Il existe des membres de cette famille chez les eucaryotes comme les protéines Pif1 et Rm3 (Ivessa et al., 2002) mais elles restent très mal décrites.

(a)

Les seules données structurales disponibles pour la famille SF1B viennent de la sous- unité RecD dont la structure a été obtenue au sein du complexe RecBCD (Singleton et al., 2004). Les caractéristiques biochimiques de la protéine RecD sont bien décrites mais toujours au sein du complexe RecBCD, ce qui rend impossible une analyse mécanistique de la protéine sans ces partenaires.

L’hélicase RecD agit ainsi à l’état monomérique mais dans le contexte d’un hétérotrimère (Nanduri et al., 2002; Singleton et al., 2004). La structure de RecD révèle que les enzymes SF1B possèdent, comme les hélicases SF1A, deux modules « RecA-like » avec un domaine de liaison à l’ATP situé à l’interface de ces deux modules (Figure 6A). La protéine RecD possède par ailleurs un domaine N-terminal supplémentaire, qui forme l’interface avec la sous-unité RecC et qui n’est pas conservé dans la protéine Dda. Enfin, la structure du complexe RecBCD montre que la protéine RecD ne lie pas l’ADN double-brin au niveau de la jonction simple-brin/double-brin, cette liaison étant assurée par la sous-unité RecB (Figures 6B et 6C).

Chez la bactérie, le complexe RecBCD protéique initie le processus de réparation par RH en convertissant les cassures d’ADN bicaténaires en extrémités simple-brin 3’ sortantes.

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Pour cela, l’hétérotrimère s’assemble sur des bouts francs d’ADN double-brin. La sous-unité RecB reconnaît l’extrémité 3’ d’ADN tandis que la protéine RecD se lie à l’extrémité 5’. La molécule d’ADN duplex est déroulée par l’association de deux activités hélicases de polarité inverse. Alors que RecB déroule l’ADN dans le sens 3’-5’, RecD le déroule dans le sens opposé 5’-3’ (Dillingham et al., 2003). Les molécules simple-brin produites sont digérées en aval de la translocation par la sous-unité RecB qui possède également une activité nucléase. Ces trois activités sont étroitement régulées par une séquence nucléotidique appelée Chi (ou #, pour « cross-over hot-spot instigator »). Cette séquence se retrouve dans le génome bactérien dans des zones de RH très élevée.

Le complexe RecBCD transloque à une vitesse de l’ordre de 600 paires de bases par seconde. À la rencontre d’une séquence #, il effectue une pause de quelques secondes qui se traduit par une atténuation de son activité nucléase, la translocation redémarre ensuite mais à une vitesse plus lente de l’ordre de 300 paires de bases par seconde (Dixon and Kowalczykowski, 1993; Spies et al., 2003). Récemment, l’équipe de Kowalczykowski a montré comment cette séquence # régule les activités hélicases des deux moteurs RecB et RecD (Spies et al., 2007), expliquant ainsi la différence de vitesse observée. Les auteurs ont montré que la protéine RecD transloque deux fois plus rapidement que la protéine RecB, et donc que la sous-unité RecD est le moteur protéique du complexe RecBCD. Ceci est vrai jusqu’à la rencontre avec la séquence #. Après le passage de cette séquence, l’activité motrice de déroulement du duplex est relayée à la sous-unité RecB (Figure 6D).

Cette étude permet ainsi de mieux comprendre comment une étroite régulation des différentes activités du complexe RecBCD par la séquence #, conduit à la génération d’une extrémité 3’ sortante nécessaire pour initier le processus de RH. Cependant, ce travail n’aborde pas les différents changements conformationnels induits par la séquence # sur les deux moteurs protéiques RecB et RecD au sein du complexe RecBCD.

(b)

Plusieurs études cinétiques mettent en évidence que la protéine Dda est capable de dérouler un duplex ADN à l’état oligomérique (Morris et al., 2001; Nanduri et al., 2002). À l’inverse, des travaux plus récents ont clairement révélé une coopérativité de plusieurs monomères de Dda dans l’activité de déroulement d’un duplex ou dans sa capacité à rompre une liaison biotine/streptavidine (Byrd and Raney, 2004, 2005, 2006).

Pour expliquer ces résultats, les auteurs ont proposé, pour la protéine Dda, un mécanisme d’action à l’échelle moléculaire qui est une variation du modèle « chenille »

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proposé pour la famille SF1A (Figure 5). Dans ce modèle, les monomères fonctionnent indépendamment durant la translocation le long de l’ADN simple-brin comme il a été proposé dans le modèle « chenille ». Par contre, lorsqu’un monomère rencontre un obstacle comme un ADN duplex ou une protéine liée à la chaîne monocaténaire, la probabilité de passer à travers cet obstacle augmente proportionnellement avec le nombre de monomères présents sur le substrat simple-brin. La coopérativité serait alors associée à des interactions transitoires entre les monomères liés au même substrat d’acide nucléique, et transloquant dans la même direction. Des données structurales font pour l’instant défaut pour mettre en évidence une telle coopération entre deux monomères de Dda.

B)

La superfamille SF2

Les enzymes de la superfamille SF2 sont une très vaste famille d’hélicase impliquées dans des processus cellulaires très variés. La famille SF2 est découpée en plusieurs sous- familles très largement étudiées, comme les hélicases ARN à boîte DEAD (leur nom fait référence à la séquence de leur boîte de Walker A) (Cordin et al., 2006; Rocak and Linder, 2004), les hélicases ADN RecQ-like (Bennett and Keck, 2004) et les enzymes de la famille Swi2/Snf2 (Flaus et al., 2006; Flaus and Owen-Hughes, 2004). La fonction biochimique du coeur catalytique des enzymes SF2 est probablement la translocation ATP-dépendante unidirectionnelle le long d’un acide nucléique simple-brin ou double-brin. Cependant, plusieurs membres agissent en appliquant une force mécanique non-processive qui altère la conformation de la protéine et de l’acide nucléique de manière ATP-dépendante.

Pendant ces dix dernières années, un nombre considérable de structure tridimensionnelle a été publié pour les hélicases SF2 (à ce jour, 12 structures sont disponibles pour la seule sous-famille des ARN hélicases). Le but de ce manuscrit n’étant pas de décrire de manière exhaustive l’ensemble de ces cristaux, ne seront donc détaillés à titre d’exemple, que certains de ces travaux apportant des données sur la mécanistique d’action à l’échelle moléculaire des enzymes SF2.

1) La famille SF2!

(a)

La protéine du virus de l’hépatite C NS3 est probablement l’enzyme SF2! la mieux caractérisée. La protéine NS3 peut dérouler des duplex ADN ou ARN de longue taille de

Figure 7 : Structure et mécanisme des hélicases SF2!. Exemple de la protéine du virus de l’hépatite C NS3. (a) Structure primaire indiquant la position et les fonctions des quatre domaines. Notez que le domaine protéase est absent de la structure présentée. (b) Complexe ADN/NS3 représenté avec le même code couleur qu’en (a), l’oligonucléotide est représenté en rose. L’ion sulfate indique la position de la poche de liaison au nucléotide situé à l’interface des domaines RecA-like. (c) Représentation des huit motifs conservés, regroupés autour de la poche de liaison au nucléotide. Les résidus clés, qui ne font pas partie des motifs hélicases, mais qui sont impliqués dans le mécanisme de translocation sont indiqués (W501 et V432, notés W et V respectivement) et colorés en noir. (d) Représentation en encombrement stérique utilisant le même code couleur qu’un (c).

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manière processive mais requiert une extrémité monocaténaire 3’ sortante (Pang et al., 2002). Bien que plusieurs observations suggèrent une interaction fonctionnelle entre plusieurs monomères de NS3 (Levin et al., 2004; Tackett et al., 2005), une étude en molécule unique indique que la forme monomérique de NS3 est un moteur protéique actif pour dérouler un acide nucléique (Dumont et al., 2006).

La structure de l’hélicase NS3 a été obtenue seule ou complexée à un ADN simple- brin (Kim et al., 1998). Le coeur catalytique est composé des deux modules « RecA-like » (notés N- et C-core Figure 7a) similaires à ceux observés pour les hélicases SF1, associés à un domaine C-terminal appelé domaine 3, jouant un rôle dans les interactions NS3/NS3 (Mackintosh et al., 2006). Le domaine N-terminal de la protéine, absent de la structure, possède une activité protéase requise pour la maturation de la polyprotéine virale.

La poche de liaison au nucléotide est située à l’interface des modules « RecA-like » (comme pour la famille SF1), alors que le site de liaison à l’ADN est situé dans une seconde poche perpendiculaire à la première, à l’interface entre le coeur catalytique et le domaine 3 non-conservé (Figures 7b, c et d). L’ensemble des motifs hélicases caractéristiques de la famille SF2 se retrouve à la surface de ces deux poches (Figure 7d). Le cœur catalytique adopte une conformation ouverte avec six bases d’ADN liés le long de sa surface supérieure à une position similaire à celle décrite pour les enzymes SF1. Cependant, ces bases ne sont pas dans une conformation étirée comme cela a été observé pour la protéine PcrA. En effet, la protéine NS3 lie la chaîne d’ADN monocaténaire principalement via des interactions avec le squelette phosphate, l’ADN simple-brin se retrouve ainsi dans une structure en pseudo forme B. Les résidus impliqués dans cette liaison sont les motifs 1a, TxGx, 4 et 5. Des contacts additionnels impliquent deux résidus V432 et W501 qui prennent en « sandwich » cinq bases à l’intérieur du cœur protéique (Figure 7d). L’importance de ces deux résidus, qui ne font pas partie des motifs hélicases canoniques, a été montrée par mutagénése dirigée (Kim et al., 2003; Paolini et al., 2000; Tai et al., 2001).

(b)

Le modèle de translocation par mouvement brownien a été proposé par l’équipe de Patel suite à plusieurs études cinétiques réalisées sur la protéine NS3 (Levin et al., 2005; Levin et al., 2003). Les auteurs ont observé dans un premier temps que l’hélicase NS3 lie l’ADN simple-brin de manière beaucoup plus faible en présence d’un analogue non- hydrolysable de l’ATP. Ensuite, ils ont montré que la liaison de la protéine NS3 à un substrat

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ADN contenant une partie monocaténaire et une partie bicaténaire, entraîne un désappariement de quelques paires de base à la jonction simple-brin/double-brin.

Dans ce modèle, en absence d’ATP, la protéine lie son substrat fortement. La liaison à l’ATP affaiblit l’interaction entre l’enzyme et l’acide nucléique, conduisant à un bref mouvement brownien aléatoire de l’hélicase. L’hydrolyse de l’ATP conduit à une nouvelle liaison de la protéine sur son substrat avec un biais énergétique dans la direction du mouvement (de 3’vers 5’ pour la protéine NS3).

La structure de NS3 suggère que le changement conformationnel se fait par l’intermédiaire du motif 1 (appartenant au domaine « RecA-like » N-terminal) et le doigt arginine contenu dans le domaine 6 (appartenant au domaine « RecA-like » C-terminal) qui en se liant à l’ATP entrainerait une fermeture des deux domaines « RecA-like » autour du nucléotide. La conséquence de cette transition se traduirait alors par une altération de la distance entre les résidus V432 et W501 et par conséquent, une baisse de l’affinité de l’enzyme pour son substrat simple-brin.

Ce mécanisme est très similaire au modèle « chenille » proposé pour la famille SF1A. La différence majeure est l’absence d’un domaine de liaison double-brin qui permet à l’enzyme de rester « agripper » à son substrat pendant le changement conformationnel induit par l’hydrolyse de l’ATP (assuré par le domaine 2B pour les protéines PcrA, Rep et UvrD, Figures 3, 4 et 5 respectivement). Cependant, l’existence de ce domaine (responsable du déroulement « actif » de l’ADN) n’est pas à exclure pour les hélicases SF2!, puisque aucune structure n’a été obtenue en présence d’un substrat contenant à la fois une partie double-brin et une partie simple-brin.

(c)

Aucune structure d’une protéine SF2! complexée à un acide nucléique dans les deux conformations ouverte et fermée n’est disponible à ce jour. En absence de cette donnée, il est difficile d’estimer le pas enzymatique associé à ce modèle. Cependant, il paraît assez improbable que ce mécanisme par mouvement brownien conduise à nombre élevé de paires de bases transloquées par ATP hydrolysé. Des études cinétiques sur la protéine NS3 ont pourtant révélé des pas assez grands (9, 11 et 18 paires de bases) ponctués éventuellement de courtes phases de déroulement de 4 paires de bases (Dumont et al., 2006; Levin et al., 2004; Serebrov and Pyle, 2004). Une autre étude a par ailleurs montré que l’hélicase SF2! NPH-II déroule l’ADN avec un pas de 6 paires de bases (Jankowsky et al., 2000). Ces valeurs sont difficilement conciliables entre elles, avec la structure de NS3 et avec le modèle par

Figure 8 : Structures des enzymes SF2!. (a) Structure primaire de la protéine de Sulfolbus solfataricus Rad54. Une large portion N-terminal de la protéine (en rose) n’a pas été

déterminée dans les structures représentées en (b) et (c). Le module nommé RecA-like N- terminal (ou C-terminal) dans le texte est noté N-core (ou C-core). (b) Structure du complexe ADN duplex/Rad54 représentée avec le même code couleur qu’en (a). Le brin d’ADN représenté en mauve est le brin appelé 3’-5’dans le texte. C’est par ce brin que se fait la majeure partie des interactions avec le module RecA-like N-terminal de la protéine. (c) Superposition des domaines RecA-like, montrant la similarité des chemins choisis par l’ADN simple-brin lié à la protéine NS3 (en orange) et le brin 3’-5’ (en mauve) lié à la protéine Rad54 (en bleu ciel). (d) Structure primaire de la protéine de Thermotoga maritima RecG. (e) Structure du complexe ADN/RecG, révélant comment le domaine accessoire (noté « wedge ») agit comme un facteur spécifique pour les jonctions d’ADN à trois branches. Notez que l’ADN duplex représenté en mauve et noir et dirigé vers le cœur protéique de RecG dans une orientation similaire à celle observée pour le complexe ADN/Rad54.

26 mouvement brownien.

2) La famille SF2"

Les enzymes SF2" ont en commun une activité ATPasique stimulée préférentiellement par de l’ADN bicaténaire. Une démonstration rigoureuse d’une translocation sur un acide nucléique double-brin est rare dans la littérature puisqu’il est difficile de visualiser une activité qui ne conduit pas à la formation de produits. Cependant, des essais de déplacement d’un triplex d’ADN ont été utilisés pour mettre en évidence une activité translocase sur de l’ADN double-brin pour plusieurs protéines (Durr et al., 2005; Firman and Szczelkun, 2000; Whitehouse et al., 2003). Récemment, plusieurs approches en molécule unique ont permis d’observer une telle activité pour les protéines bactériennes FtsK et EcoR124I (Pease et al., 2005; Saleh et al., 2004; Stanley et al., 2006).

(a)

Le seul cristal disponible d’une enzyme SF2" liée à un ADN duplex, vient de la protéine de Sulfolbus solfataricus Rad54 (Durr et al., 2005), un membre de la famille Swi2/Snf2 (Flaus et al., 2006). Les ATPases de la famille Swi2/Snf2 transloquent le long d’un ADN double-brin en provoquant des torsions de la double-hélice, mais ne possèdent pas d’activité hélicase (Havas et al., 2000; Ristic et al., 2001). Ces protéines sont impliquées dans les mécanismes de remodelage de nucléosome, et de manière plus vaste, dans le déplacement de protéine liée à l’ADN (Flaus and Owen-Hughes, 2004).

La structure du noyau catalytique de la protéine est composée des deux modules « RecA-like », associés à deux domaines de fonction inconnue retrouvée dans aucune structure d’hélicase et/ou translocase (Figures 8a et 8b). Le module « RecA-like » C-terminal dans cette structure subit une rotation de 180° par rapport à sa position canonique. Cette transition, conduisant à une conformation étirée du noyau catalytique, a déjà été observée de manière similaire, mais pas identique, pour les hélicases ARN VASA et eIF4A (Caruthers et al., 2000; Sengoku et al., 2006). La signification de cette réorientation n’est pas connue, mais pourrait être à l’origine d’un couplage entre la liaison au substrat et/ou au nucléotide et un important réarrangement conformationnel des domaines de l’enzyme. La protéine Rad54 pourrait ainsi lier son substrat dans une conformation ouverte étendue avant que la translocation démarre.

Le module « RecA-like » N-terminal interagit avec les deux brins d’ADN le long du sillon mineur. Les contacts impliquent les motifs 1a et les motifs spécifiques de la famille

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Snf2 et se font principalement avec le squelette phosphodiester de l’acide nucléique. Les interactions du duplex ADN avec le module « RecA-like » C-terminal sont minimes, reflétant son orientation inhabituelle. Une superposition des modules « RecA-like » N-terminal des protéines Rad54 et NS3, montre que la position du brin 3’-5’ du duplex est virtuellement identique à celle du brin monocaténaire dans la structure de la protéine NS3 (Figure 8c), la plupart des contacts protéine/ADN se fait avec ce brin.

Cette observation est en accord avec les résultats obtenus sur la protéine EcoR124I, montrant que des modifications ou une discontinuité sur le brin 3’-5’ inhibent plus fortement la translocation de l’enzyme relativement à celles sur le brin 5’-3’ (Stanley et al., 2006). L’ensemble de ces données suggèrent que les moteurs protéiques SF2" lient principalement un seul brin du duplex ADN.

Cependant, les protéines NS3 et PcrA possédent un domaine additionnel qui prend en « sandwich » le brin monocaténaire. Le module « RecA-like » N-terminal de Rad54 ne possède pas un tel domaine qui viendrait enfermer le brin 3’-5’. Cette différence notoire avec les hélicases SF1 et SF2! peut expliquer l’absence d’activité hélicase des protéines Swi2/Snf2.

(b)

La conservation dans le mode de reconnaissance du brin 3’-5’ entre la protéine Rad54 et l’hélicase NS3, suggère que la force motrice requise pour la translocation le long du sillon mineur de l’ADN double-brin, soit similaire à celle qui conduit à la translocation des hélicases le long d’un ADN simple-brin. Pour les hélicases, cette force motrice est dirigée par une interaction entre les motifs 1 et 6 et l’ATP, qui produit une fermeture entre les deux modules « RecA-like ». Une structure fermée de Rad54 autour d’un ADN bicaténaire n’est pas disponible aujourd’hui. Mais une modélisation de cette transition conduit à un alignement de tous les motifs nécessaires à la liaison et à l’hydrolyse de l’ATP à l’intérieur du site actif de l’enzyme (Durr et al., 2005).

Il a ainsi été proposé un modèle de translocation pour les enzymes SF2" tout à fait similaire au modèle « chenille » décris Figure 5. Pour les hélicases SF1, le changement conformationnel provoqué par la liaison à l’ATP entre les deux modules « RecA-like », se traduit par un mouvement du domaine 2B qui vient s’appuyer sur la partie double-brin. Cette force induite par le domaine 2B sur l’ADN, qui agît ainsi comme une « cale », provoque le déroulement d’une paire de base à la jonction simple-brin/double-brin. Pour la protéine Rad54, le rôle du domaine 2B serait joué par le domaine représenté en orange Figures 8a et

Figure 9 : Structure de la protéine XPD. (A) Comparaison de l’organisation des domaines entre la protéine humaine et la protéine de Sulfolobus tokodaii. Le module RecA-like N- terminal est représenté en bleu ciel, le module RecA-like C-terminal en rose, le domaine arche (noté « arch ») en saumon, le domaine FeS en vert. Les positions des motifs hélicases canoniques sont indiquées par des barres colorées. La région p44 de la protéine humaine représentée en gris n’est pas retrouvée chez les archæa. (B) Structure de la protéine d’archæa XPD représentée avec le même code couleur qu’en (A). Le domaine arche (haut de la structure) émerge du module RecA-like C-terminal. Le domaine FeS est désorganisé dans cette structure. Seuls les deux sites d’ancrage de ce site sont indiqués par des billes vertes. L’ion phosphate dans le site de liaison à l’ATP est indiqué en représentation par encombrement stérique. (C) La position de l’ADN, représenté en rouge, est dérivée de la structure de l’hélicase Hel308, établie en superposant les deux modules RecA-like. (D) Représentation en encombrement stérique de la protéine d’archæa XPD dans la même orientation qu’en (B) (à gauche) et avec une rotation de 90° (à droite). Les résidus chargés négativement et positivement sont représentés en rouge et bleu respectivement. Le petit canal délimité par le domaine arche et le module RecA-like N-terminal est tapissé par des résidus basiques et ne peut contenir que de l’ADN monocaténaire. (E) Schéma représentant le chemin emprunté par l’ADN. Le duplex ADN entrant par la droite est déstabilisé par le domaine FeS.