Prolifération in vitro de cellules procaryotes

3.1. Milieux de cultures bactériens in vitro

R. Koch [12] peut être considéré comme le véritable fondateur de la microbiologie. C'est lui qui développa les principales méthodes encore utilisées aujourd'hui : milieux nutritifs adaptés à toutes sortes de bactéries, culture des bactéries sur milieu solide, colorations spécifiques… On lui doit, entre autre, la découverte du bacille de la tuberculose et du vibrion du choléra. Mais, en France, c’est le nom de L. Pasteur qui reste attaché à la naissance de la microbiologie.

Même si certains micro-organismes se développent facilement, un milieu de culture doit-être préparé afin d’augmenter leur vitesse de multiplication [13]. Il doit aussi satisfaire leur exigences nutritives ce qui implique :

- de couvrir les besoins en ions minéraux et d’apporter une source de carbone et d’énergie,

- de présenter un pH ainsi qu’une force ionique optimale.

Il existe une grande variété de milieux de culture en rapport avec la diversité des exigences nutritives des micro-organismes. Il est possible de distinguer les milieux empiriques des milieux synthétiques.

Les milieux empiriques sont de composition approximative car cela dépend des matières premières utilisées : extrait de viande ou de levure, peptones, sucres et éventuellement liquides biologiques (sérum, sang…). Les composants du milieu doivent convenir aux micro-organismes étudiés. Ce sont les milieux les plus employés aujourd’hui comme, par exemple, les milieux LB, Columbia, Gassner, …

Les milieux synthétiques sont de composition exactement connue, qualitativement et quantitativement. Ces milieux sont surtout utilisés pour l’étude des bactéries autotrophes ou pour étudier les besoins nutritifs d’un germe.

Il est possible de favoriser la culture de certains micro-organismes par rapport à d’autres en jouant sur la composition du milieu : les milieux pourront être sélectifs ou non-sélectifs. La majorité des procaryotes ont besoin d’une surface solide à laquelle adhérer pour former un biofilm. Un milieu de culture solide et facile à reproduire est nécessaire, il est obtenu en ajoutant un agent gélifiant à un milieu liquide. Le gélifiant le plus utilisé est l’agar-agar ou gélose, l’addition de diverses autres molécules ne posant aucun problème particulier. L’agar-agar est un polygalactoside sulfaté que très peu de micro-organismes sont capables de dégrader. Il présente la propriété de former avec l’eau un gel solide à une température inférieure à 60 °C tout en étant liquéfiable par ébullition, auquel cas, il reste en surfusion jusqu’aux environs de 45°C.

Les milieux solides destinés à être coulés en boîte de Pétri ou en tube ont une teneur en gélose assez élevée (15 g.L^-1) tandis que les géloses molles ou semi-solides sont peu gélosées (3 à 5 g.L^-1).

3.2. Modes de vie bactériens

Il existe de nombreux types bactériens différents qui vivent dans des milieux naturels variés [13]. Afin d’en réussir la culture in vitro, il est nécessaire de connaître les caractéristiques de vie des bactéries. Un premier classement du genre bacteria peut s’organiser suivant la nature des nutriments consommés. Les bactéries peuvent être autotrophes ou hétérotrophes :

- l’autotrophie consiste à assimiler des nutriments d’origine inorganique ce qui permet de ne pas avoir besoin de molécules organiques pour assurer la survie, par exemple les cyanobactéries,

- l’hétérotrophie inclut les bactéries qui ont la nécessité de consommer des éléments organiques pour proliférer. De part cette dépendance, elles représentent un danger pathogène pour les espèces eucaryotes. La majorité des bactéries connues sont hétérotrophes : les staphylocoques, les bacilles, …

Une deuxième classification peut être effectuée par la nature et la forme de la paroi bactérienne. Il est possible d’observer deux formes de parois : les coccis et les bacilles. Les coccis sont de forme ronde et les bacilles sont cylindriques.

Indépendamment, il existe deux types de parois : - les parois épaisses mais uniques,

- celles plus fines mais doublées.

C’est le bactériologiste danois H. C. Gram [14] qui mit au point en 1884 un protocole de coloration qui permet d’identifier les deux types de parois. Les différentes étapes de cette coloration sont succinctement les suivantes :

- coloration par le violet de gentiane (cristal violet) pendant 30 secondes à 1 minute, suivie d’un rinçage à l'eau pure. Le violet de gentiane se fixe sur les composants des parois de toutes les bactéries,

- fixation du colorant avec du lugol (solution composée de diiode et d’iodure de potassium en solution dans de l’eau) pendant 30 secondes à 1 minute, suivie d’un rinçage à l'eau déminéralisée également,

- décoloration rapide à l’alcool : l’alcool ou un mélange alcool-acétone est versé au goutte à goutte sur une lame inclinée obliquement jusqu’à ce que le filet de solvant résultant soit clair. Cette étape est suivie d’un rinçage abondant avec l’eau déminéralisée pour stopper la décoloration. Cette étape doit être effectuée avec délicatesse, l’utilisation abusive de l’alcool aurait pour conséquence de rendre le test faux,

- recoloration à la safranine ou à la fuchsine, pendant 30 secondes à 1 minute. Un dernier lavage à l’eau déminéralisée doit être réalisé suivi d’un séchage de la lame à 50°C.

L’alcool sert à décolorer la paroi des bactéries qui seront dites Gram négatif (ou Gram-). Celle-ci, plus fine, va en effet laisser passer l’alcool (molécule hydrophile) ou le mélange alcool-acétone ce qui provoquera la décoloration en éliminant le violet de gentiane.

Au contraire, pour les bactéries dites Gram positif (ou Gram+), la paroi est plus épaisse et constitue une barrière imperméable à l'alcool. Elles resteront alors de couleur violette.

L'étape de recoloration est une contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries Gram négatif précédemment décolorées une teinte rose permettant de les visualiser au microscope.

Les bactéries à Gram positif restées violettes seront évidemment insensibles à cette contre-coloration plus pâle que le violet imprégnant leur cytoplasme.

La coloration de Gram permet de différencier la paroi bactérienne et de scinder les bactéries en deux grands groupes : les Gram+ qui ont une paroi épaisse comme les Lactobacillus et les Gram- qui ont une paroi fine mais ont en plus une membrane externe comme, par exemple,

Escherichia coli. Alors que les bactéries Gram+ sont pour la plupart des germes non exigeants, c'est-à-dire qu'ils se cultivent facilement dans les milieux de base, les organismes Gram- sont plus difficiles à cultiver in vitro.

Une dernière classification concerne leurs conditions physiques de propagations : la plupart des bactéries ont besoin du support de culture sur lequel elles fabriquent un film adhésif et protecteur qui est appelé biofilm [15]. Le biofilm présente souvent plusieurs genres de bactéries qui vivent en symbioses au travers d’un comportement coopératif [16]. Lorsque que la bactérie survit seule dans un milieu liquide sans former de biofilm, le mode de vie est dit planctonique.