Projet de thèse

Comme il l’a été abordé précédemment, les plantes mettent en place de nombreux mécanismes moléculaires pour maintenir leur homéostasie en fer. Pour permettre une fine régulation de cette balance, le fer est prélevé dans le sol, transporté dans la plante, stocké et utilisé de façon très dynamique tout en évitant qu’il génère un stress oxydatif préjudiciable.

Les ferritines, en séquestrant le fer afin qu’il ne soit pas libre dans la cellule, ont un rôle important dans le maintien de l’homéostasie. AtFER1 est le gène de ferritines le plus exprimé et dont les transcrits sont les plus accumulés en réponse au fer. Il est donc considéré comme modèle d’étude pour la régulation de l’expression des gènes de ferritines chez

Arabidopsis. Il est très majoritairement régulé transcriptionnellement, et ce par trois voies

indépendantes. Par ailleurs, sur un plan strictement cognitif, la régulation de l’expression d’AtFER1 est un modèle de choix pour l’étude des mécanismes impliqués dans la régulation de l’expression des gènes, notamment en raison du nombre et de la complexité des voies potentiellement impliquées. Dans ce contexte, l’objectif a été abordé selon 2 axes différents :

(i) J’ai tout d’abord mis en place une étude fonctionnelle du promoteur d’AtFER1. Dans ce but, j’ai créé des lignées stables d’Arabidopsis exprimant le gène rapporteur GUS (β-glucuronidase) sous le contrôle de différentes versions du promoteur d’AtFER1 (délétions en 5’ et en 3’, mutagénèse dirigée). Le but de cette approche, en plus d’évaluer la spécificité tissulaire, a été de mettre en évidence le rôle des multiples éléments cis, leurs liens éventuels et leurs « forces » d’induction ou de répression (Chapitre I).

(ii) Dans un second temps, j’ai cherché à identifier des facteurs en trans impliqués dans la régulation de l’expression d’AtFER1. Dans ce but, j’ai mis en place un crible simple hybride en levure. Cette approche a permis d’identifier plusieurs facteurs de transcription pouvant moduler l’activité du promoteur d’AtFER1. Parmi eux, un semble particulièrement intéressant car il est lui-même lié à la réponse à la carence en fer. Il s’agit du facteur de transcription bHLH105/ILR3 (Chapitre II).

D’autre part, lors de sa thèse (2007), Nicolas Arnaud a identifié un long ARN non codant (At5g01595) pouvant potentiellement réguler AtFER1. Dans le cadre de ma thèse, un des objectifs était d’identifier s’il existe un rôle pour At5g01595 dans le contrôle de l’expression d’AtFer1, en étudiant notamment un mutant perte de fonction pour le LncRNA d’AtFER1 (Chapitre III).

Les mécanismes moléculaires et physiologiques mis en place par les végétaux en réponse à une carence en fer sont relativement bien décrits, et restent toujours très étudiés. A

32 l’inverse, peu d’informations sur la réponse des plantes à un « excès » de fer sont disponibles. Au niveau moléculaire, la majeure partie des données accumulées l’a été via l’étude de la régulation de l’expression d’AtFER1. Afin de mieux appréhender la séquence des évènements qui se jouent au niveau moléculaire, il a été choisi de travailler à l’échelle du génome, et plus particulièrement du transcriptome, en prenant en compte l’aspect dynamique de cette réponse. En effet, la réponse des plantes aux variations environnementales est un phénomène qui s’effectue à différents pas de temps, depuis la perception de l’excès (quelques secondes) jusqu’au rééquilibrage du métabolisme et du programme développemental (plusieurs heures/jours). L’objectif principal de cette étude visait donc à étendre la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu par les plantes en réponse à un « excès » de fer dans le milieu de culture. En nous focalisant sur les mécanismes qui contrôlent l’expression des gènes, il s’agissait notamment de déterminer les réseaux de régulation qui sont impliqués dans les étapes précoces de la réponse. Cette approche a permis de mettre en place une cinétique d’induction par le fer en se basant sur les niveaux d’accumulation des transcrits d’AtFer1, puis de générer les données de transcriptomique (puces à ADN Affymetrix) nécessaires à l’identification des acteurs impliqués dans la réponse précoce à un excès de fer, avant que l’expression d’AtFER1 ne soit induite (Chapitre IV).

Enfin, l’homéostasie du fer est particulièrement maintenue grâce au prélèvement de ce dernier dans le milieu. L’assimilation du fer est régie par un système de prélèvement bien caractérisé (FRO2/IRT1). En plus de ce système de transport ancré dans les cellules de l'épiderme de la racine, une étude menée par Pierre Fourcroy (Chercheur dans l’équipe d’accueil) a montré que la nutrition en fer était facilitée par la synthèse et la sécrétion de composés phénoliques via le transporteur PDR9. Pierre a observé que chez les mutants pdr9, une suraccumulation de composés phénoliques était observable dans les vacuoles. Dans le but d’identifier un transporteur vacuolaire responsable de ce phénomène, j’ai mis en place une comparaison transcriptomique du mutant pdr9 par rapport au sauvage en réponse à la carence en fer. Ce microarray a permis d’identifier quelques gènes pouvant avoir un rôle dans le stockage de ces composés dans la vacuole (Chapitre III). De plus, j’ai cherché à caractériser si le prélèvement du fer par le mécanisme FRO2/IRT1 était lié aux composés phénoliques excrétés par le transporteur PDR9. Plus précisément, le but de cette approche était de savoir si le fer solubilisé par les composés phénoliques était bien prélevé par IRT1. Une caractérisation de mutants affectés dans le prélèvement a donc été mise en place en fonction de différents traitements minéraux (Chapitre V).

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Chapitre I : Etude

fonctionnelle des promoteurs

des gènes de ferritines.

Figure 17 : Représentation schématique du promoteur minimal d’AtFER1.

Représentation schématique des promoteurs de ferritines chez Arabidopsis thaliana avec les éléments cis-régulateurs conservés (ELEMs). L’ensemble des éléments cis-cis-régulateurs sont compris dans les 239 paires de bases en amont du site d’initiation de la transcription. Seuls les ELEM 2 et 3 d’AtFER1 et l’ELEM 1 d’AtFER2, 3 et 4 diffèrent entre les gènes de ferritines (A). Le modèle du promoteur minimal d’AtFER1 a été conçu selon (i) les résultats de l’étude menée par Strozycki et al., 2010 combinés à (ii) une analyse complémentaire réalisée à l’aide du logiciel PLACE (A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements, http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) qui permet d’identifier des séquences cis-régulatrice déjà répertoriées (B). Le promoteur minimal d’AtFER1 est composé de 6 régions (ELEM) comprenant des séquences régulatrices potentiellement susceptibles de participer à la régulation transcriptionnelle du gène. ELEM 2 est composé de deux cis-éléments: un élément ABRE (réponse à l’acide abscissique, non démontré pour AtFER1) et un élément P1BS impliqué dans la régulation de l’expression d’AtFER1 en réponse à la carence en phosphate. ELEM 3 comprend un élément T-box et un élément FeRE. Ce dernier élément pourrait jouer un rôle dans la régulation de l’expression d’AtFER1 en réponse au fer. ELEM 4 est constitué de l’IDRS (répresseur de l’expression d’AtFER1). ELEM 7 est composé d’une E-box (proposée comme répresseur de l’expression d’AtFER1). ELEM 5 est composé d’un élément GATA et d’une G-box. Enfin, nous avons identifié ELEM 6 (nommé « new element ») qui présente des similitudes de séquence avec l’IDRS et pour lequel aucun rôle n’a été identifié. Tous ces éléments sont compris dans la région promotrice comprise entre 239 pb et 120 pb en amont du site

d’initiation de la transcription d’AtFER1.

P1BS T-box IDRS E-box GATA 5’

496 pb

239 pb

ABRE FeRE G-box AtFER

1

120 pb

2 3 4 7 5 6

ELEM :

5’

500 pb 239 pb

ELEM : ² 3 4 5 6

AtFer1

AtFer3

AtFer2

AtFer4

4

4

4

5

5

5

6

6

6

1

1

1

3’

109 pb

A

B

217 pb 202 pb 169 pb 155 pb 137 pb

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