Identification d’un modèle de travail pour le promoteur d’AtFER1

Le fer est impliqué dans l’induction de l’expression du gène de ferritine AtFER1 chez

Arabidopsis. Dans le but d’obtenir un support de travail optimal pour la caractérisation

détaillée des différents éléments du promoteur d’AtFER1 (décrits précédemment), une série de délétions aux extrémités 5’ et 3’ de ce dernier a été réalisée (Fig. 18 et 19).

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux délétions générées à l’extrémité 5’. Le promoteur d’AtFER1 chez Arabidopsis est long de 1,478 Kb (Kilo-bases Fig. 18A). Lorsque la construction de 1,478 Kb fusionnée au gène uidA (codant la GUS : b-glucuronidase) est exprimée dans des plantules d’Arabidopsis, en situation de carence en fer, on observe une accumulation de précipité bleu dans l’ensemble des tissus : les cotylédons, les jeunes feuilles, l’hypocotyle et les racines, avec une plus forte accumulation vers les apices (Fig. 18C ; panels de gauche encadrés en noir, -Fe). Au niveau cellulaire, l’activité GUS est

5’

35Smini

5’

5’

-1,478 Kb

-0,946 -0,496

A _B

C

5’

pAtFER1

-1478/

-496pb

-496pb

rosette _{cotylédon racine rosette cotylédon racine}

-1478/

-946pb

-946/

-496pb

Figure 19 : Observation de l’activité du promoteur d’AtFER1 en fonction de la disponibilité en fer : délétions en 3’.

Des plantules exprimant le gène uidA (GUS) sous le contrôle de différentes délétions en 3’ et en 5’ du promoteur d’AtFER1 ont été cultivées durant 10 jours sur milieu MS/2. Ces plantes ont ensuite été transférées dans un milieu carencé en fer durant 3 jours puis ont subi un excès de fer (500µM) pendant 24 heures (+Fe) ou sont restées en condition carencée (-Fe). Représentation schématique des constructions. Les barres oranges représentent le promoteur minimal 35S (35Smini) (A). Analyse quantitative de l’activité GUS. Les barres d’erreur correspondent aux écarts-types (n=6). La significativité de la différence entre les constructions (indépendamment du traitement) a été déterminée par un test de Student (* = p.value<0,05, **= p.value<0,01,

***=p.value<0,001) (B). Coloration GUS des plantules après traitement (12h à 37°C). Les images encadrées

en noir correspondent aux plantes carencées en fer, les images encadrées en rouge à celles en excès. Barres d’échelle : 2mm pour les rosettes et 1mm pour les cotylédons et les racines (C).

nmol MU/min/mg de protéines *** *** *** *** *** ***

36 localisée au niveau des cellules péri-vasculaires (données non montrées), ce qui concorde parfaitement avec les données bibliographiques (Reyt et al., 2015). D’après les résultats obtenus, nous pouvons observer qu’en situation de carence en fer, l’activité GUS semble diminuer proportionnellement à la taille du promoteur (Fig. 18C ; panels de gauche encadrés en noir -Fe). Ce constat est confirmé par les résultats de GUS quantitatif (Fig. 18B). L’activité de l’enzyme est corrélée à la taille du promoteur avec une absence d’activité pour le promoteur de 239 pb (paires de bases). En excès de fer, le constat est différent. En effet, l’induction de l’expression est conservée malgré les différentes tailles des promoteurs (Fig. 18C panels de droite encadrés en rouge, +Fe). Lorsque l’on analyse les activités des promoteurs de façon quantitative cette observation est confirmée (Fig. 18B). Toutefois, le promoteur de 239 pb ne semble pas être activé par l’excès de fer (Fig. 18B). Ces résultats montrent que les régions promotrices en 5’ des 496 pb régulent l’intensité de l’induction de l’expression d’AtFER1. Ces résultats suggèrent également que l’induction par le fer se fait grâce au 496 pb en amont du site d’initiation de la transcription. Enfin, ils montrent le rôle indispensable de la région de 257 pb comprise entre les promoteurs de 239 et 496 pb. Le promoteur de 0,496 Kb semble donc être indispensable pour l’induction par le fer et nécessaire pour le niveau basal d’expression.

Afin de confirmer ces observations, des délétions à l’extrémité 3’ du promoteur ont été également produites en excluant la région de 496 pb avant le site d’initiation de la transcription (Fig. 19A). L’absence de coloration bleue traduit une perte de l’expression du gène AtFER1 lorsque les séquences promotrices de 496 pb et de 946 pb sont supprimées en 3’ (Fig. 19C). Nous pouvons cependant constater une faible activité GUS lorsque la séquence de -946 pb à -496 pb en amont du site d’initiation à la transcription est conservée (Fig. 19C). L’induction par le fer ne modifie pas l’activité GUS sur cette région du promoteur confirmant les résultats précédents (Fig. 19C ; panels de droite encadrés en rouge, +Fe). La mesure quantitative de l’activité GUS a permis de confirmer ces observations (Fig. 19B). Ces résultats suggèrent que la région de -1,478 Kb à -0,946 Kb en amont du site d’initiation à la transcription semble agir comme un élément inhibiteur de l’expression du gène d’AtFER1. De plus, ils démontrent que l’intensité de l’induction de l’expression d’AtFER1 (mesurée via l’activité GUS) est corrélée à la taille du promoteur utilisé. La présence d’un niveau basal d’expression avec un promoteur de 496 pb ainsi que l’absence d’expression, lorsqu’il est retiré, indique que ce fragment est nécessaire et suffisant à l’expression du gène en condition carencée en fer (niveau basal) et à l’induction de l’expression par le fer. Cette séquence contient vraisemblablement les éléments régulateurs du gène AtFER1 comme supposés dans

-0,946

5’

-1,478 Kb

5’

5’

-0,496

A B

nmol MU/min/mg de protéines

Figure 20 : Observation de l’activité du promoteur d’AtFER3 en fonction de la disponibilité en fer : délétions en 5’.

Des plantules exprimant le gène uidA (GUS) sous le contrôle de différentes délétions en 5’ du promoteur d’AtFER3 ont été cultivées durant 10 jours sur milieu MS/2. Ces plantes ont ensuite été transférées dans un milieu carencé en fer durant 3 jours puis ont subi un excès de fer (500µM) pendant 24 heures (+Fe) ou sont restées en condition carencée (-Fe). Représentation schématique des constructions (A). Analyse quantitative de l’activité

GUS. Les barres d’erreur correspondent aux écarts-types (n=6). La significativité de la différence entre les

constructions (indépendamment du traitement) a été déterminée par un test de Student (* = p.value<0,05, **= p.value<0,01, ***=p.value<0,001) (B).

*

37 le modèle (Fig 17B). La région promotrice de 496 pb a donc été considérée comme le promoteur minimal d’AtFER1 dans la suite du travail.

2.2 Le promoteur minimal d’AtFER1 comme modèle d’étude pour les autres