Les éléments cis impliqués dans l’expression d’AtFER1

Afin de confirmer l’implication de certains domaines du promoteur de 496 pb dans la régulation transcriptionnelle d’AtFER1, j’ai analysé l’activité de plusieurs variants du promoteur minimal d’AtFER1 (pAtFER1-496pb, muté ou non pour les différents ELEMs, en réponse à une carence et à un excès de fer. Les mutations ont été réalisées sur la base de l’étude fine de la séquence du promoteur minimal d’AtFER1 (Fig. 17B) ainsi que sur la base des éléments publiés comme éléments cis-régulateurs. Les éléments concernés ici sont (i) l’ELEM 2 contenant le P1BS (ciblé par PHR1 et PHL1 en carence en phosphate), et un motif

ABRE (ACGTG) également potentiellement impliqué , (ii) l’ELEM 4 composé de l’IDRS (voie

de dé-répression par le fer) et (iii) l’ELEM 7 constitué d’une Ebox (ciblée par PRR7 pour la régulation circadienne d’AtFER1) (Fig. 21A).

Figure 21 : Observation de l’activité du promoteur minimal d’AtFER1 en fonction de la disponibilité en fer : effet des mutations dans les élément cis-régulateurs du promoteur déjà décrits dans la littérature. Des plantules exprimant le gène uidA (GUS) sous le contrôle de différentes versions mutées du promoteur d’AtFER1 ont été cultivées durant 10 jours sur milieu MS/2. Ces plantes ont ensuite été transférées dans un milieu carencé en fer durant 3 jours puis ont subi un excès de fer (500µM) pendant 24 heures (+Fe) ou sont restées en condition carencée (-Fe). Représentation schématique des constructions (A). Coloration GUS des plantules après traitement (12h à 37°C). Les images encadrées en noir correspondent aux plantes carencées en fer, les images encadrées en rouge à celles en excès. Barres d’échelle : 2mm pour les rosettes et 1mm pour les

cotylédons et les racines (B). Analyse quantitative de l’activité GUS. Les barres d’erreur correspondent aux

écarts-types (n=6). La significativité de la différence entre les constructions (indépendamment du traitement) a été déterminée par un test de Student (* = p.value<0,05, **= p.value<0,01, ***=p.value<0,001) (C, D).

B

pAtFER1

-496pb

rosette cotylédon racine rosette cotylédon racine

P1BS IDRS E-box 5’

500 pb

239 pb ^{120 pb}

2 3 4 7 5 6

ELEM :

mE4*

(IDRS)

mE2*

A

mE7*

(Ebox)

C

nmol MU/min/mg de protéines

D

nmol MU/min/mg de protéines

ABRE * ** ^*** *** *** ***

38 Des observations ont été réalisées à la fois dans les parties aériennes (rosette, cotylédons) et dans les parties racinaires (Fig. 21B).

pAtFER1 -496 pb présente une activité GUS basale lorsque la plante est en condition

carencée en fer, qui augmente en réponse à un excès de fer (Fig. 21B, panels de gauche encadrés en noir). En absence de fer (-Fe), les lignées avec l’ELEM 2 muté (mE2*) présentent un signal plus faible que pAtFER1 -496 pb (Fig. 21B). L’activité GUS associée à cette mutation est conservée au niveau des zones périvasculaires mais est plus faible, et presque nulle dans les autres tissus observés. Les lignées avec l’ELEM 4 (mE4*, IDRS) muté présentent dans ces mêmes conditions une expression beaucoup plus forte que pAtFER1 -496pb (Fig. 21B). Enfin, les lignées pour lesquelles l’ELEM 7 (mE7*, E-box) est muté sont similaires à pAtFER1 -496 pb (Fig. 21B). Ces résultats démontrent que l’ELEM 2 participe au maintien de l’expression basale d’AtFER1. L’ELEM 4 est lui impliqué dans des voies inhibitrices de l’expression du gène (ce qui confirme les données publiées sur l’IDRS ; Petit et

al., 2001). L’ELEM 7 semble lui, ne pas avoir de rôle majeur sur l’expression d’AtFER1 dans

ces conditions. En effet, lorsqu’il est muté il présente une activité GUS comparable au promoteur de 496 pb non muté.

Dans le but de comprendre comment les éléments régulateurs sont liés à la réponse à l’excès de fer (+Fe), les plantes ont subi un stress ferrique de 24h (ajout de 500 mM de fer dans le milieu) et ont été observées selon le même protocole qu’en condition -Fe (niveau basal, Fig. 21B). Les lignées mutées pour les ELEMs 2 et 7 conservent une induction transcriptionnelle du gène en réponse à un excès de fer (Fig. 21B, panels de droite encadrés en rouge). Les lignées mutées pour l’ELEM 4 ne semblent pas présenter un signal plus fort en réponse au fer par rapport à leurs expressions basales respectives. Ces observations montrent que les ELEMs 2 et 4 jouent un rôle majeur dans le contrôle de l’expression d’AtFER1 pour sa régulation transcriptionnelle basale. Ils ont des rôles opposés en absence de fer : l’ELEM 2 est inducteur alors que l’ELEM 4 inhibe la transcription d’AtFER1. En ce qui concerne la réponse à l’excès de fer, seul l’ELEM 4 semble être impliqué car l’induction d’AtFER1 est perdue lorsqu’il est muté (Fig. 21B).

Afin d’évaluer plus spécifiquement le rôle de ces éléments dans l’expression d’AtFER1, des mesures quantitatives d’activité GUS ont été mises en place (Fig. 21C et D). L’ensemble des observations sur les ELEMs 4 et 7 a été validé par cette approche (Fig. 21C). Dans le but de caractériser précisément la fonction de l’ELEM 2, ce dernier a été muté à deux endroits distincts respectivement au sein des motifs ABRE et P1BS (Fig. 21D). Les lignées avec l’élément cis ABRE muté présentent le même profil d’activité que celles avec le

B

pAtFER1

-496pb

rosette cotylédon racine rosette cotylédon racine

5’

500 pb

239 pb ^{120 pb}

2 3 4 7 5 6

ELEM :

A

T-box FeRE GATA G-box

mE5*

mE3*

mE6*

C D

Figure 22 : Observation de l’activité du promoteur minimal d’AtFER1 en fonction de la disponibilité en fer : mutations dans les éléments cis putatifs du promoteur (non décrits dans la littérature).

Des plantules exprimant le gène uidA (GUS) sous le contrôle de différentes versions mutées du promoteur d’AtFER1 ont été cultivées durant 10 jours sur milieu MS/2. Ces plantes ont ensuite été transférées dans un milieu carencé en fer durant 3 jours puis ont subi un excès de fer (500µM) pendant 24 heures (+Fe) ou sont restées en condition carencée (-Fe). Représentation schématique des constructions (A). Coloration GUS des plantules après traitement (12h à 37°C). Les images encadrées en noir correspondent aux plantes carencées en fer, les images encadrées en rouge à celles en excès. Barres d’échelle : 2mm pour les rosettes et 1mm pour les cotylédons et les racines (B). Analyse quantitative de l’activité GUS. Les barres d’erreur correspondent aux écarts-types (n=6). La significativité de la différence entre les constructions (indépendamment du traitement) a

été déterminée par un test de Student (* = p.value<0,05, **= p.value<0,01, ***=p.value<0,001) (C, D).

0 20 40 60 80 100 120 pAtFER1 FeRE* pAtFER1 Tbox* pAtFER1 mE3* pAtFER1 -496 bp -Fe + Fe

nmol MU/min/mg de protéines nmol MU/min/mg de protéines

0 100 200 300 pAtFER1 Gbox* pAtFER1 GATA* pAtFER1 mE5* pAtFER1 -496 bp ^-Fe + Fe *** *** *** ** ^* * ** *

39 promoteur minimal non muté. En revanche, les lignées mutées dans le P1BS ont une activité semblable à celle observée chez les lignées mutées pour l’ELEM 2 (Fig. 21D). Ces résultats démontrent que le P1BS est un domaine crucial dans la régulation du gène via l’ELEM 2. De plus, ils suggèrent que les observations obtenues sur l’ELEM 2 muté, semblent être dues à la mutation du P1BS seul.

2.4 Les éléments cis conservés potentiellement impliqués dans la régulation