3. Discussion
3.2 Les éléments répresseurs de l’expression d’AtFER1
L’expression d’AtFER1 est finement régulée et implique de nombreux éléments cis-régulateurs. Comme évoqué précédemment, le promoteur d’AtFER1 est régulé par des voies inductrices. En revanche, les résultats obtenus lorsque les ELEMs 4 et 5 sont mutés confirment et montrent respectivement que ces derniers sont impliqués dans l’inhibition de l’expression d’AtFER1 (Fig. 21). L’IDRS constituant l’ELEM 4 est publié comme jouant un rôle d’inhibiteur fort de l’expression d’AtFER1 en réponse à la carence en fer (Petit et al. 2001). En effet, l’expression d’AtFER1 est bloquée par l’intermédiaire d’un répresseur inconnu à ce jour. Lors d’un excès de fer, il serait dégradé par une voie dépendante du protéasome 26S (Arnaud et al., 2006) et un facteur inducteur viendrait alors activer la transcription. L’ELEM 5 lui comprend une G-box (CACGTG) et une GATA (TATC) mais
47 parmi elles, seule la G-box semble avoir un rôle sur la régulation transcriptionnelle de l’expression d’AtFER1 (Fig. 22).
En ce qui concerne l’IDRS, mes résultats confirment les données de Petit et al., (2001) qui placent cet élément comme la boite majeure d’inhibition d’AtFER1. Ce motif se définit par deux répétitions en tandem de la séquence CACNNCNG. Dans son étude, JM Petit démontre, en mutant une répétition de l’IRDS puis les deux, que ces deux motifs ne sont pas indispensables pour inhiber AtFER1. En effet la mutation d’une seule ou des deux répétitions entraînent la même réponse : une forte hausse d’activité correspondant à la levée d’inhibition. Le facteur accroché sur l’IDRS n’est pas identifié et ce malgré les nombreuses approches mises en place. Il a été démontré par des approches de gel retard, que même en présence de fer un facteur de transcription est accroché sur l’IDRS. Dans ces expérimentations, la séquence de l’IDRS était toujours plus longue et englobait par exemple également l’ELEM 3. Nous pouvons donc imaginer qu’en gel retard, en présence de fer, une protéine s’accroche à la
FeRE et non à l’IDRS entraînant le retard de migration. Mais cette hypothèse reste à ce jour
spéculative.
Afin de caractériser plus finement le mode de fonctionnement de l’élément IDRS, il serait intéressant de l’introduire dans les promoteurs de gènes qui ne sont pas en lien avec l’homéostasie du fer. Ainsi nous pourrions évaluer si cette séquence est à elle seule capable de bloquer la transcription ou si elle est dépendante des éléments qui l’entourent. D’autre part, une approche de double mutation (FeRE/IDRS par exemple) permettrait également d’identifier l’élément cis dominant pour la régulation d’AtFER1 et de déterminer comment les voies s’intègrent entre elles. Par ailleurs j’ai récemment observé qu’il existait une séquence correspondant à un demi IDRS situé à 109 pb en amont du site d’initiation de la transcription. J’ai réalisé une expérience préliminaire sur des lignées exprimant le promoteur minimal d’AtFER1 fusionné au GUS avec ce pseudo élément IDRS muté. J’ai pu observer par analyse quantitative que l’activité GUS en condition contrôle était augmentée et que l’induction par l’excès de fer était conservée. Ces données très préliminaires permettent de supposer que l’inhibition d’AtFER1 passe par deux, voire trois séquences de type IDRS (CACNNCNG). L’analyse de lignées GUS contenant le promoteur minimal d’AtFER1 avec les trois éléments de type IDRS reste à être réalisée afin de déterminer s’il existe un effet additif entre ces motifs nucléotidiques. Enfin ce type de régulation, par désinhibition, laisse penser à un mécanisme très dynamique qui permet la transcription des ferritines sur un pas de temps très court afin de répondre efficacement à différents stimuli.
48 Au cours de ces expériences j’ai pu identifier que la séquence G-box est un élément répresseur de l’expression d’AtFER1 (Fig. 22D). Lorsque ce motif est muté, l’induction par le fer est conservée, ce qui indique que cette G-box serait impliquée dans une voie de régulation indépendante de la voie fer impliquant l’IDRS. Les G-box sont des motifs hexamériques dont la séquence canonique est un palindrome (CACGTG). Elles ont été identifiées pour la première fois dans les régions promotrices des gènes codant pour des composantes de la RuBisCo (Ribulose 1.5-bisphosphate carboxylase/oxygénase ; Giuliano et al., 1988). Les facteurs de transcription de type bHLH reconnaissent les G-box, mais peuvent également s’accrocher sur des séquences proches appelées E-box (CANNTG). Ces deux motifs sont présents dans le promoteur d’AtFER1 et sont localisés à moins de 18 pb l’un de l’autre. La
E-box a été publiée comme étant un élément inhibiteur de l’expression d’AtFER1 via le facteur
de transcription PRR7. Dans nos conditions, la G-box joue un rôle beaucoup plus important dans le contrôle de l’activité du promoteur d’AtFER1 que la E-box qui ne semble pas impliquée dans ce mécanisme. L’élément trans impliqué dans l’inhibition d’AtFER1 via la
G-box restait à être identifié lorsque j’ai réalisé ces expériences.
Mes résultats sur l’activité du promoteur minimal dans le mutant tic-2 (Fig. 26) montrent que le profil est très semblable à celui retrouvé chez les lignées comportant la G-box mutée. En effet, dans les lignées pAtFER -496 bp tic-2, une forte augmentation de l’activité du promoteur est observée tout en conservant l’induction par le fer. Il se pourrait donc qu’il existe un lien avec les études précédentes et que TIC soit impliqué dans la régulation transcriptionnelle de l’expression d’AtFER1 via la G-box. TIC est une protéine nucléaire impliquée dans la régulation du rythme circadien (Ding et al., 2007). Cette protéine a été également identifiée comme coordinateur central de la régulation de l’homéostasie minérale, du développement, de la signalisation hormonale et de la réponse aux stress biotiques et abiotiques des plantes (Shin et al., 2012 ; Sanchez- Villarreal et al., 2013). Par exemple, TIC inhibe l’accumulation du facteur de transcription MYC2 (bHLH6) afin de moduler la signalisation du jasmonate chez Arabidopsis. Il est possible que dans notre système, TIC module la stabilité et la disponibilité d’un facteur de type bHLH qui viendrait inhiber l’expression d’AtFER1. Dans le but d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués, différentes formes du promoteur minimal d’AtFER1 (mutées ou non) ont été introgressées dans le fond mutant tic-2. De plus, des approches de co-immuno précipitations (Co-IP) sont en train d’être réalisées dans l’équipe afin d’identifier in planta les intéractants potentiels de TIC. Cette approche a récemment été utilisée avec succès par un autre groupe et a permis
P1BS IDRS
5’
496
FeRE G-box2 3 4 5
+ -
AtFer
1
3’
Expression en réponse à la carence en fer
FT
1
FT
2 FT3 FT4
Expression en réponse à l’excès de fer
P1BS IDRS
5’
496
FeRE G-box2 3 4 5
AtFer
1
3’
FT
1
FT
2 FT4
Expression en réponse à la carence en phosphate
P1BS IDRS
5’
496
FeRE G-box2 3 4 5
AtFer
1
3’
FT
2 FT4
PHR1
Figure 27 : Représentation schématique des mécanismes moléculaires connus impliqués dans la régulation transcriptionnelle de l’activité du promoteur minimal d’AtFER1 en fonction de la disponibilité en fer et en phosphate.
L’ensemble des éléments cis-régulateurs sont compris dans les 239 paires de bases en amont du site
d’initiation de la transcription. Cette région peut être scindée en deux parties : une inductrice regroupant
les éléments 2 et 3 (ELEM 2 & 3) et une répressive regroupant les éléments 4 et 5 (ELEM 4 & 5). Lors d’une carence en fer, l’expression d’AtFER1 est maintenue faiblement par des facteurs de transcription reconnaissant le P1BS et la FeRE (FT1 & FT2). En parallèle, des protéines s’accrocheraient aux séquences IDRS pour inhiber la transcription (FT3 & FT3’). Lors d’un excès de fer, FT3 et FT3’ seraient dégradés et ainsi FT1 et FT2 pourraient induire fortement l’expression d’AtFER1. En situation de carence en phosphate, en plus de l’effet « excès de fer » généré physiologiquement, PHR1, PHL1 et FT2 viendraient induire la transcription. L’inhibition via la G-box impliquerait un facteur de transcription (FT4) en lien potentiel avec la protéine TIC. Les conditions dans lesquelles FT4 réprime AtFER1 via la
G-box ne sont pas connues.
PHL1
TIC
TIC
FT3’
49 d’identifier un complexe protéique impliquant TIC associé à la boucle du soir de l’horloge circadienne (Huang et al., 2016).