Préparation des essais de désadénylation in vitro :

Il était d’intérêt de savoir si l’interaction entre BTG2(APRO) et PABPC1 avait une quelconque influence sur l’activité désadénylase de CNOT7. Pour répondre à cette question, j’ai mené des expériences de désadénylation in vitro.

Les essais de désadénylation consistent en la mise en présence d’un substrat polyadénosines, marqué en 5’ avec de la fluorescéine, avec différentes associations de protéines BTG, Tob, CNOT7 et/ou PABPC1. Les produits de dégradation obtenus sont ensuite fractionnés sur gel de polyacrylamide dénaturant puis visualisés par fluorescence. La première étape de préparation a été de purifier les protéines qui allaient être utilisées dans l’essai.

2.2.1.1 Purification des protéines :

Figure R4 : Protéines utilisées pour les premiers essais de désadénylation in vitro.

5 µg de chaque protéine ont été fractionnés sur gel SDS-PAGE 12% et détectés par coloration au bleu de Coomassie.

Les différentes protéines utilisées dans les essais de désadénylation sont présentées sur la Figure R4. Elles correspondent à des protéines marquées avec 6 histidines en N-terminal, qui correspondent à CNOT7 (6His-CNOT7), PABPC1 sauvage complète (6His-PABPC1(FL)), ou à une protéine PABPC1 tronquée ne comprenant que les deux premiers domaines RRM (6His- PABPC1(1-190)). Des protéines de fusion avec la GST ont également été utilisées ; il s’agit du

70 kDa 55 kDa 35 kDa 25 kDa 15 kDa 10 kDa M

domaine APRO de BTG2 sauvage (GST-BTG2(APRO)) et du domaine APRO de Tob1 sauvage (GST-Tob1(APRO)). Dans certaines expériences, la protéine BTG2(APRO), obtenue après clivage de l’étiquette GST par la thrombine, a aussi été utilisée. La protéine GST seule a également été purifiée pour servir de contrôle. Après expression dans Escherichia coli, ces protéines ont été purifiées, soit uniquement par chromatographie d’affinité manuelle, soit par chromatographie d’affinité suivie d’une chromatographie d’exclusion stérique par HPLC (High Performance Liquid Chromatography, voir Matériel et Méthodes). La Figure R4 représente le profil obtenu après migration de 5 µg de chaque protéine sur gel SDS-PAGE 12%. La faible quantité de 6His- PABPC1(FL) observée est très vraisemblablement due à la présence de nombreux fragments protéiques plus petits dans l’échantillon, ce qui conduit à une inexactitude dans l’estimation de la quantité de 6His-PABPC1(FL).

2.2.1.2 Synthèse d’un substrat de 75 adénosines marqué à la fluorescéine :

Afin d’évaluer l’activité désadénylase de CNOT7 in vitro, des substrats d’une taille approchant les 75 adénosines ont été obtenus par extension d’un oligonucléotide ARN d’une taille de 20 adénosines marqué en 5’ à la fluorescéine, à l’aide de la Poly(A) Polymérase d’E. coli. Un résumé de la méthode utilisée ainsi qu’un exemple de substrats obtenus après purification par électrophorèse sur gel acrylamide dénaturant sont présentés en Figure M2 de la section Matériel et Méthodes. D’après les études antérieures de PABPC1 (Baer and Kornberg, 1983) un substrat d’une taille proche de 75 adénosines devrait pouvoir être lié par trois molécules de 6His-PABPC1(FL). Ce choix a été fait afin de ne pas occulter un hypothétique effet de la liaison coopérative de PABPC1 à un substrat polyadénosines sur l’activité désadénylase de CNOT7.

2.2.1.3 Mise au point d’un tampon de réaction adapté :

Les conditions réactionnelles ont dû être mises au point afin de permettre à la fois la liaison de 6His-PABPC1(FL) au substrat polyadénosines et l’activité désadénylase de 6His-CNOT7 in vitro. Pour ce faire, le substrat polyadénosines a été incubé à une concentration de 100 nM dans divers tampons (IIA, IIB, IIC, IID, IIE et IIF, compositions détaillées dans la légende de la Figure R5) soit en présence d’un excès théorique de 1,2 µM de 6His-PABPC1(FL) soit en présence de 1,8 µM de 6His-CNOT7. Après incubation pendant 0 ou 20 min, les ARN présents dans les échantillons ont été fractionnés sur gel natif acrylamide 6% afin de permettre la visualisation de la

désadénylation du substrat, ou de son association avec 6His-PABPC1(FL) par la technique de retard sur gel (EMSA). Le gel obtenu est présenté en Figure R5.

Figure R5 : Détermination d’un tampon permettant le recouvrement d’un substrat polyadénosines par 6His-PABPC1(FL) ainsi que sa dégradation par CNOT7 in vitro.

Visualisation de la capacité de 6His-PABPC1(FL) à lier un substrat polyadénosines par la technique d’EMSA et visualisation de la capacité de 6His-CNOT7 à dégrader ce même substrat in vitro en présence de différents tampons. Un substrat de 75 adénosines marqué en 5’ à la fluorescéine (100 nM) a été incubé en présence de divers tampons avec soit 1,2 µM de 6His- PABPC1(FL) pendant 20 min à 23°C, soit avec 1,8 µM de 6His-CNOT7 pendant 20 min à 30°C. Les réactions ont ensuite été

chargées sur gel d’acrylamide natif 6% puis migrées à 3W à 4°C pendant 2h avant révélation avec un appareil ImageQuantTM

LAS4000. Les compositions des différents tampons utilisés sont présentées ci-dessous.

IIA IIB IIC IID IIE IIF

10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 0,5 mM DTT 0,1% NP-40 1 mM MgAc 20 mM HEPES KOH 100 mM KCl 10 mM DTT 0,1% NP-40 1 mM MgAc 20 mM HEPES KOH 100 mM KCl 0,5 mM DTT 0,1% NP-40 5 mM MgAc 10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 10 mM DTT 0,1% NP-40 1 mM MgAc 20 mM HEPES KOH 100 mM KCl 10 mM DTT 0,1% NP-40 5 mM MgAc 10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 0,5 mM DTT 0,1% NP-40 5 mM MgAc Réaction (min) 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 0 20 20 20 20 20 20 20 - - - + - - - - IIB - - + + - - - + + - - - + - - - IIC - - - - + + - - - + - - IID - - - + + - - - + - - - - - + + - - - + - - - - - - - - IIF - - - - - - - - - - + - - - - - IIA + + - - - - IIE - Tampons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 6His-CNOT7 6His-PABPC1(FL) + - - + 5’Fluo-poly(A)75

Comme on peut le constater, tous les tampons testés lors de cette expérience permettent la désadénylation partielle d’un substrat polyadénosines au bout de 20 min (puits 2, 4, 6, 8, 10 et 12), ainsi qu’une liaison totale de 6His-PABPC1(FL) au substrat adénylé au bout de 20 min (puits 13 à 18). On remarque cependant que la présence d’acétate de magnésium (MgAc) à une concentration de 5 mM, permet une meilleure activité de CNOT7 en comparaison des tampons ne présentant qu’1 mM MgAc (comparer les puits 2, 4 et 8 aux puits 6, 10 et 12). On constate également qu’à composition identique, l’utilisation de 10 mM Tris au lieu de 20 mM HEPES diminue l’activité de CNOT7 (comparer le puits 12 au puits 10, respectivement), tandis que l’augmentation de la concentration en agent réducteur DiThioThreitol (DTT) de 0,5 à 10 mM ne semble pas affecter l’activité de CNOT7 (comparer le puits 6 au puits 10, respectivement). Ainsi, le tampon IIC qui entraîne l’une des plus fortes désadénylations du substrat au bout de 20 min (puits 6) a été choisi comme tampon par défaut pour les réactions de désadénylation.

2.2.1.4 Mise au point de la quantité de 6His-PABPC1 nécessaire à la liaison totale au substrat :

Ayant trouvé un tampon permettant à la fois l’activité désadénylase de 6His-CNOT7 ainsi que la liaison de 6His-PABPC1(FL) à un substrat polyadénosines, j’ai voulu connaître les quantités minimales des protéines PABPC1, complètes ou ne comportant que les deux premiers domaines RRM, nécessaires au recouvrement total du substrat. Pour ce faire, j’ai incubé pendant 20 min à 23°C 100 nM de substrat polyadénosines en présence de quantités croissantes de 6His- PABPC1(FL) (concentrations de 0,075 µM ; 0,15 µM ; 0,3 µM ; 0,6 µM et 1,2 µM) ou de 6His- PABPC1(1-190) (concentrations de 0,175 µM ; 0,35 µM ; 0,7 µM ; 1,4 µM et 2,8 µM). Puis les produits réactionnels ont été fractionnnés sur gel d’acrylamide natif 6%, les gels obtenus sont présentés en Figure R6. On observe un retard croissant de la migration du substrat polyadénosines parallèlement à l’augmentation des quantités de 6His-PABPC1(FL) ou 6His-PABPC1(1-190) présentes dans chaque réaction (comparer les puits 1, 2, 3, 4, 5 et 6 de la Figure R6a), puis de la Figure R6b) respectivement). On constate qu’en présence de 0,6 µM de 6His-PABPC1(FL) ou de 0,35 µM de 6His-PABPC1(1-190), le substrat est presque totalement recouvert par PABPC1 (Figure R6a) puits 5 et Figure R6b) puits 3 respectivement), et qu’il est totalement recouvert en présence de 1,2 µM de 6His-PABPC1(FL) ou 0,7 µM de 6His-PABPC1(1-190) (Figure R6a) puits 6 et Figure R6b) puits 4 respectivement). Au vu des résultats de ces expériences, une quantité de 0,7 µM de 6His-PABPC1(FL) ou de 6His-PABPC1(1-190) pour 100 nM de substrat a été choisie

pour effectuer les réactions de désadénylation. Un excès de 6His-PABPC1(1-190) de 7 fois en concentration par rapport au substrat n’est pas surprenant, étant donné qu’il a été montré par étude structurale que les deux premiers domaines RRM sont les domaines de PABPC1 qui lui procurent la plus grande affinité pour une extension polyadénylée, et que ces deux domaines peuvent recouvrir 12 résidus adénosines (Deo et al., 1999) soit environ un septième de la taille du substrat polyadénosines utilisé dans les essais de dégradation in vitro.

Figure R6 : Détermination de la quantité optimale de 6His-PABPC1(FL) et de 6His- PABPC1(1-190) pour le recouvrement total d’un substrat d’environ 75 adénosines.

(a) Un substrat de 75 adénosines marqué en 5’ à la fluorescéine (100 nM) a été incubé à 30°C avec des concentrations croissantes de 6His-PABPC1(FL) comme indiqué dans du tampon IIC pendant 20 min à 30°C. Les réactions ont ensuite été chargées sur gel d’acrylamide natif 6% puis migrées à 3W à 4°C pendant 2h avant

révélation avec un appareil ImageQuantTM _{LAS4000. (b) Un substrat de 75 adénosines marqué en 5’ à la}

fluorescéine (100 nM) a été incubé à 30°C avec des concentrations croissantes de 6His-PABPC1(1-190) comme indiqué dans du tampon IIC pendant 10 min à 30°C. Les réactions ont ensuite été chargées sur gel d’acrylamide

natif 6% puis migrées à 3W à 4°C pendant 2h avant révélation avec un appareil ImageQuantTM _LAS4000.