4.17.1 Transcription in vitro et ajout de coiffe en 5’ des ARN :
Trois plasmides exprimant la Renilla Luciférase ou la Firefly Luciférase ont été préalablement linéarisés par une étape de digestion avec des enzymes de restriction afin que chaque transcrit présente ou non une queue poly(A), de séquence ((A)25GUUAU(A)25UUU), codée par les
plasmides. Précisément, 50 µg de plasmide T7-Renilla Luc-SV40 poly(A) (pBS 4848), T7-Firefly Luc-A50 (pBS 530) ou T7-Renilla Luc-A50 (pBS 5502) ont été digérés par 250 U d’enzyme XbaI, 250 U d’enzyme BamHI (constructions sans poly(A)) ou 250 U d’enzyme DraI (constructions avec poly(A)) pendant 1h à 37°C dans un volume total de 500 µl de tampon CutSmart (New England Biolabs). Les produits de digestion ont ensuite été purifiés par extraction au PCI et précipitation à l’éthanol comme décrit en 4.6. 50 µg de plasmide digéré ont servi de matrice pour une réaction de transcription en présence de 0,4 U/µl T7 RNA Polymerase (Promega), 10 mM DTT, 1U/µl d’inhibiteurs de RNAses RNasin (Promega) et 0,5 mM rNTPs dans un volume final de 500 µl de Transcription optimized buffer. Trois incubations d’1h à 37°C ont été effectuées, en ajoutant 200 U de T7 RNA Polymerase (Promega) après la première et la deuxième incubation. Les 50 µg de plasmides matrices ont ensuite été digérés par 50 U de RQ1 RNase-free Dnase (Promega) pendant
30 min à 37°C. Les ARN ainsi transcrits ont été purifiés par extraction au PCI et précipitation à l’éthanol comme décrit en 4.6. 50 µg d’ARN ont ensuite été coiffés pendant 30 min à 37°C à l’aide de la Vaccinia Capping Enzyme (New England Biolabs) en présence de 0,5 mM GTP et de 0,1 mM SAM dans un volume total de 100 µl de tampon Capping buffer. Les ARN ainsi coiffés ont été purifiés à l’aide du protocole RNA clean up from reaction du kit NucleoSpin RNA (Macherey- Nagel). 1 µg des ARN obtenus ont été migrés pendant 90 min à 600V sur un gel d’acrylamide dénaturant 4%. Le gel a ensuite été révélé par incubation pendant 10 min sous agitation avec le réactif Stains-All (Fisher). Une étape de décoloration à la lumière du jour ou sous une lampe a ensuite permis l’acquisition de l’image du gel avec un scanner (Figure M3).
Figure M3 : Transcrits luciférases utilisés pour les essais de traduction in vitro.
(a) Représentation schématique des transcrits luciférases présentant ou non une queue poly(A) de séquence 25A- GUUAU-25A-UUU. (b) Migration de 1 µg de chaque ARN purifié présentant une coiffe en 5’ sur gel d’acrylamide dénaturant 4% coloré avec le réactif Stains-All (Fisher), capable de colorer aussi bien les ARN, l’ADN que les protéines. Les transcrits Firefly et Renilla ont été synthétisés en utilisant respectivement les vecteurs pBS530 et pBS5502. Après linéarisation par enzymes de restriction des plasmides codant pour les rapporteurs, ces derniers ont été transcrits avec la T7 RNA Polymérase (Promega). La coiffe en 5’ a été ajoutée à l’aide de la Vaccinia Capping
Enzyme (New England Biolabs), puis les ARN ont été purifiés à l’aide du kit NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel).
4.17.2 Essai de dégradation d’un substrat luciférase par XRN1 après traitement apyrase :
Un transcrit luciférase (39 nM) a été mis en présence de 0,03 U/µl Apyrase (New England Biolabs) et de tampon NEB 3, durant 1h à 37°C. L’apyrase a ensuite été inactivée pendant 20 min à 65°C. La réaction a alors été complétée par 0,03 U/µl d’enzyme XRN1 (New England Biolabs) puis incubée pendant 1h à 37°C. La réaction a finalement été interrompue par l’ajout d’un volume de PCI. Les échantillons ont ensuite été purifiés par extraction au PCI et précipitation à l’éthanol
Firefly luciférase Renilla luciférase - + - + Queue Poly(A) Coiffe en 5’ + + + + Luc
ORF 3’UTR Poly(A)
Luc ORF 3’UTR a) b) coiffe coiffe 3’OH 5’ 3’OH 5’
comme décrit en 4.6. Un volume de tampon de charge ARN a ensuite été ajouté avant dénaturation à 65°C pendant 5 min. Enfin, l’échantillon a été chargé et migré pendant 90 min à 600V sur un gel d’acrylamide dénaturant 4%. Le gel a ensuite été révélé par incubation pendant 10 min sous agitation avec le réactif Stains-All (Fisher). Une étape de décoloration à la lumière du jour ou sous une lampe a ensuite permis l’acquisition de l’image du gel avec un scanner.
4.17.3 Essai de traduction avec un lysat de réticulocytes de lapin :
75 nM d’un transcrit luciférase ont été incubés en présence de 10 µM d’un mélange d’acides aminés fourni avec le lysat de réticulocytes, de 0,8 U/µl d’inhibiteurs de RNAses RNasin (Promega), et de lysat de réticulocytes de lapins (Promega). Les réactions ont ensuite été incubées durant 90 min à 30°C, puis trois quarts de chaque réaction ont été répartis équitablement dans trois puits d’une plaque 96 puits (Perkin ElmerTM), auxquels sont ajoutés 50 µl de réactifs luciférases issus d’un des
kits suivants : Dual-Luciferase® Reporter Assay System, Renilla Luciferase Assay System, Luciferase Assay system (Promega). La plaque a ensuite été analysée par un lecteur de plaques, qui après injection et mélange de 50 µl de réactif, a permis une mesure de l’activité Firefly ou Renilla pendant 10 sec.
4.17.4 Préparation d’un extrait de cellules HeLa S3 permettant la traduction in vitro :
L’extrait a été obtenu en adaptant la méthode décrite dans Current Protocols in Cell Biology (Witherell, 2001). Une culture en suspension de 6l de cellules HeLa S3, présentant 430 000 cellules/ml avec 8% de cellules mortes, a été utilisée. Après centrifugation à 2 800 g pendant 10 min, les cellules ont été séquentiellement lavées au PBS froid et centrifugées 8 min à 640 g trois fois de suite. Le culot a ensuite été remis en suspension dans 1,5 volumes de tampon hypotonique, puis le gonflement des cellules a été permis par incubation sur glace pendant 10 min. Les cellules ont ensuite été lysées par 200 coups de piston A à l’aide d’un homogénéisateur Dounce de 40 ml. Une lyse de cellules supérieure à 95% a été vérifiée par addition de bleu de trypan à une fraction de l’extrait et observation au microscope optique à contraste de phase à un grossissement de 400 fois. L’extrait a ensuite été centrifugé consécutivement 5 min à 640 g (pour débarrasser l’extrait des débris cellulaires et des noyaux) puis 20 min à 10 400 g (pour débarrasser l’extrait des mitochondries). L’extrait a ensuite été dialysé durant 3h contre 4 litres de tampon de dialyse à l’aide de membranes de dialyse en collodion de 12 kDa. L’extrait ainsi dialysé a été centrifugé 10 min à 12 100 g avant aliquotage et stockage à -80°C.
4.17.5 Essai de traduction avec un extrait de cellules HeLa S3 :
L’extrait protéique obtenu précédemment a été traité ou non avec 0,005 KU/µl micrococcal nucléase (New England Biolabs) pendant divers temps à 37°C, puis complémenté avec 162,5 mM KOAc, 0,51 mM MgAc et du tampon de traduction. Diverses dilutions de protéines GST ou BTG2, réalisées dans 10 mM HEPES pH 7.5, 70 mM NaCl et 1 mM DTT, ont été ajoutées ou non à l’extrait ainsi que différentes concentrations de transcrit Firefly Luciférase et/ou de transcrit Renilla Luciférase polyadénylé ou non polyadénylé et présentant ou non une coiffe en 5’. Les réactions ont ensuite été incubées durant plusieurs heures à 30°C, puis trois quarts de chaque réaction ont été répartis équitablement dans trois puits d’une plaque 96 puits (Perkin ElmerTM), auxquels ont été ajoutés 50 µl de réactifs issus d’un des kits cités précédemment. La plaque a ensuite été analysée par un lecteur de plaques, qui après injection et mélange de 50 µl de réactif, a permis une mesure de l’activité Firefly ou Renilla pendant 10 sec.
4.17.6 Essai de dégradation d’un substrat luciférase dans l’extrait de traduction :
38,3 nM de transcrit luciférase ont été mis en présence d’extrait cellulaire d’HeLa S3 ainsi que de diverses concentrations de GST ou de domaine APRO de BTG2 sauvage purifiées. Les réactions ont été incubées à 30°C pendant une durée variable, puis complétées par du tampon PK et 0,30 µg/µl protéinase K. Après 10 min de traitement à 37°C, un volume de PCI a été ajouté aux échantillons. Les échantillons ont été purifiés par extraction au PCI et précipitation à l’éthanol comme décrit en 4.6. Un volume de tampon de charge ARN a été ajouté aux échantillons puis, après dénaturation à 65°C pendant 5 min, les échantillons ont été finalement chargés et migrés sur gel d’acrylamide dénaturant 4%. Le gel a ensuite été révélé par incubation pendant 10 min sous agitation avec le réactif Stains-All (Fisher). Une étape de décoloration à la lumière du jour ou sous une lampe a permis l’acquisition de l’image du gel avec un scanner.