Durant ma thèse, j’ai mis en œuvre plusieurs stratégies afin de détecter une interaction entre BTG2(APRO) et PABPC1 in cellulo. Entre autres, j’ai réalisé des essais de Proximity Ligation Assay afin de visualiser la présence de BTG2(APRO)-HA et de PABPC1 endogène à moins de 40 nm l’une de l’autre. Cependant, ces essais n’ont pas été concluants étant donné que toutes les protéines étiquetées HA utilisées comme contrôle négatif ont généré des signaux PLA avec PABPC1 endogène. Ce résultat est peut-être dû à la présence abondante de PABPC1 dans le cytoplasme ainsi qu’à la sur-expression par transfection transitoire des diverses protéines testées. Par ailleurs, étant donné qu’un ribosome possède une taille avoisinant les 30 nm (Ben-Shem et al., 2011) et que PABPC1 interagit avec des protéines impliquées dans la traduction comme eIF4G et eRF3, il est possible que PABPC1 se trouve à proximité de toutes les protéines lors de leur traduction, engendrant ainsi des signaux PLA quelle que soit la protéine sur-exprimée dans les cellules. J’ai également procédé à des expériences de co-immunoprécipitation. Dans un premier temps, ces tests, réalisés ou non après traitement trichostatine A, n’ont pas permis de visualiser une interaction in cellulo entre BTG2 et PABPC1. Cependant, ce résultat était sans-doute dû à une interaction instable entre ces protéines puisque, après traitement avec un agent de réticulation, il a été possible de visualiser une co-précipitation spécifique de PABPC1 endogène avec une protéine GFP-BTG2(APRO)-HA. Ainsi, le domaine APRO de BTG2 est capable de lier PABPC1 in cellulo, ce qui n’avait jamais été démontré auparavant. De plus, j’ai montré qu’une mutation du motif boxC, qui consiste au remplacement de la séquence DGSIC, conservée entre BTG1 et BTG2, par la séquence KGPVK retrouvée chez Tob1, diminuait fortement la liaison de BTG2(APRO) au premier domaine RRM de PABPC1 sans pour autant affecter de façon marquante l’association de BTG2 à CAF1. Par ailleurs, des expériences d’ultra-centrifugation analytique menées par un autre membre de l’IGBMC ont permis de mettre en évidence que la liaison de BTG2(APRO) à PABPC1 et à CAF1 n’étaient pas mutuellement exclusives. Ainsi, j’ai contribué à démontrer que le domaine APRO de BTG2 est capable de s’associer à la fois à CAF1 et à PABPC1 et nécessite l’intégrité de la région boxC afin de lier le premier domaine RRM de PABPC1, tandis que Tob1 interagit avec CAF1 via son domaine APRO et s’associe au domaine MLLE de PABPC1 à l’aide de ses motifs PAM2 (Ezzeddine et al., 2007; Okochi et al., 2005). Une étude antérieure à ma thèse avait déjà mis
en lumière le fait que BTG2 était capable de stimuler la désadénylation d’un rapporteur β-globine in cellulo (Mauxion et al., 2008). Durant ma thèse, j’ai pu montrer grâce au mutant BTG2(APRO)boxC que la stimulation de la désadénylation d’un rapporteur β-globine in cellulo par BTG2(APRO) nécessitait l’interaction entre BTG2(APRO) et PABPC1 (Figure D1).
Il est à noter que la région boxC de BTG2 a été identifiée au préalable comme nécessaire pour l’interaction de BTG2 avec PRMT1 (Berthet et al., 2002; Lin et al., 1996). Ces auteurs ont en effet montré qu’une protéine BTG2, délétée de la séquence DGSICVLYEA située juste en aval du motif boxB, et donc nommée boxC, n’interagissait plus avec PRMT1. Mes résultats semblent donc en contradiction avec leurs résultats puisque j’ai montré qu’une séquence boxC modifiée après substitution de la séquence DGSIC de boxC par la séquence KGPVK retrouvée chez Tob1 à la même position permet toujours la liaison à PRMT1. Donc, ces résultats suggèrent que la séquence
BTG2 Tob1 CNOT7 DEDD PRMT1 PABPC1 CNOT7 DEDD PABPC1 RRM1 RRM2 RRM3 RRM4 MLLE A B A B C RRM1 RRM2 RRM3 RRM4 MLLE ? A) B)
Figure D1 : Bilan des interactions de BTG2 et Tob1 avec PRMT1 et/ou PABPC1.
A- Bilan des interactions entre BTG2, CNOT7, PRMT1 et PABPC1
Les différentes protéines CNOT7, BTG2, PABPC1 et PRMT1 sont représentées. Le domaine DEDD de CNOT7, les régions boxA (A), boxB (B), et boxC (C) de BTG2, ainsi que les domaines RRM1, RRM2, RRM3, RRM4 et MLLE de PABPC1 sont annotés. Les régions d’interaction entre les différentes protéines sont reliées par des pointillés. B- Bilan des interactions entre Tob1, CNOT7 et PABPC1
Les différentes protéines CNOT7, Tob1 et PABPC1 sont représentées. Le domaine DEDD de CNOT7, les régions boxA (A) et boxB (B) de Tob1, ainsi que les domaines RRM1, RRM2, RRM3, RRM4 et MLLE de PABPC1 sont annotés. Les motifs PAM2 de Tob1 sont représentés en vert. Les régions d’interaction entre les différentes protéines sont reliées par des pointillés.
VLYEA de boxC est responsable de l’interaction à PRMT1. Par ailleurs, on peut également émettre l’hypothèse que l’interaction avec PRMT1 est assurée par le motif GXXXVLY retrouvé chez BTG1, BTG2, Tob1 et Tob2 (Berthet et al., 2002), en partant de la supposition que ces quatre protéines sont capables de s’associer à PRMT1, même si l’interaction entre PRMT1 et Tob1 ou Tob2 n’a jamais été testée. La vérification de la capacité de Tob1 et Tob2 à lier PRMT1 par expérience de double-hybride et de co-immunoprécipitation, ainsi que la résolution des structures des complexes BTG2(APRO)-PRMT1 et BTG2(APRO)-PABPC1 permettrait d’éclaircir les différents résultats obtenus concernant cette interaction par l’identification des acides aminés et/ou des structures tridimensionnelles requises pour les interactions.
3.2 Le domaine APRO de BTG2 permet d’augmenter l’activité désadénylase de CAF1 in