Optimisation de l’expression des protéines de fusion dans des cellules HEK293 Tet-

Off :

Pour cela, j’ai transfecté des cellules HEK293 Tet-Off avec des plasmides exprimant soit des protéines BTG, étiquetées HA ou fusionnées à la GFP, soit la GFP seule. Les western blot correspondants sont présentés en Figure R40.

BTG3(V1) A B A B BTG3(V2) BTG4 A B 252 aa 296 aa 223 aa

Figure R40 : Vérification de l’expression des constructions BTG3 et BTG4 marquées GFP ou HA.

Des cellules HEK293 Tet-Off ont été transfectées en duplicata avec (a) 2,4 µg d’un plasmide exprimant les protéines BTG étiquetées HA en N-terminal ou (b) la protéine GFP seule ou les protéines BTG fusionnées à la GFP en N- terminal comme indiqué. La présence de protéines d’intérêt a été observée par western blot soit après révélation avec un anticorps anti-HA soit après révélation avec un anticorps anti-GFP.

On constate que les variants de BTG3 ainsi que la protéine BTG4 étiquetées HA ne sont pas détectés, contrairement au domaine APRO de BTG2 (Figure R40a), BTG2(A)-HA). Par contre, les protéines de fusion GFP-BTG3 et GFP-BTG4 sont détectées, mais beaucoup plus faiblement que la GFP seule (Figure R40b)). J’ai ensuite voulu vérifier si ces protéines de fusion GFP étaient fonctionnelles. Pour ce faire j’ai testé si ces protéines étaient bien capables de lier CNOT7, un des paralogues humains de CAF1. Après transfection de cellules HEK293 Tet-Off avec des plasmides exprimant les protéines de fusion GFP-BTG2(A), GFP-BTG3 et GFP-BTG4, j’ai réalisé une immunoprécipitation avec des billes GFP-Trap (voir Matériel et Méthodes). Les lysats cellulaires et les éluats correspondants ont été analysés par western blot (Figure R41). On constate que toutes les protéines de fusion BTG sont détectées dans les fractions d’élution (Figure R41a)).

western blot anti-GFP

15 kDa 25 kDa 35 kDa 55 kDa 70 kDa

western blot anti-HA

15 kDa 25 kDa 35 kDa 55 kDa 70 kDa 5 6 7 8 1 2 3 4 a) b) M M M

Figure R41 : Vérification de la liaison de BTG3 et BTG4 à CNOT7 endogène.

(a) Des cellules HEK293 Tet-Off ont été transfectées en duplicata avec 2 µg de plasmide exprimant GFP seule ou une protéine BTG de fusion marquée GFP en N-terminal : soit le domaine APRO de BTG2 (GFP-BTG2(A)), BTG3(V1) (GFP-BTG3(V1)), BTG3(V2) (GFP-BTG3(V2)) ou BTG4 (GFP-BTG4). Après précipitation avec des billes GFP-trap, la présence des protéines d’intérêt a été observée par western blot avec un anticorps anti-GFP. (b) La présence de protéines d’intérêt dans les lysats cellulaires a été observée par western blot après révélation anti-CNOT7 afin d’évaluer l’expression endogène de CNOT7 (puits 1 à 10). La présence de protéines d’intérêt dans les éluats a été observée par western blot après révélation avec un anticorps anti-CNOT7 afin de vérifier si les constructions BTG utilisées précipitent ou non la protéine CNOT7 endogène (puits 11 à 20).

De plus, on détecte CNOT7 dans tous les lysats cellulaires obtenus avec les cellules transfectées (Fig R41b) puits 1 à 10). Dans cette expérience, on constate que GFP-BTG2(A) co-précipite faiblement CNOT7, avec un signal presque indétectable pour l’un des deux réplicas (Figure R41b) puits 11 et 12) ; ce résultat est en désaccord avec les résultats obtenus au préalable (voir Figure R1)

15 kDa 25 kDa 35 kDa 55 kDa 70 kDa

Éluats, western blot αGFP

15 kDa 25 kDa 35 kDa 55 kDa 70 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CNOT7 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Lysats, western blot αCNOT7 Éluats, western blot αCNOT7

a)

b)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

M M

et l’explication de cette différence n’est pas connue. Par ailleurs on constate que GFP-BTG3(V1) co-précipite CNOT7, mais pas GFP-BTG3(V2) (Figure R41b) comparer les puits 13-14 avec les puits 15-16, respectivement). Cela est très vraisemblablement dû à l’insertion de 44 acides aminés présente dans le domaine APRO de BTG3(V2) (au niveau de boxB) qui empêcherait l’interaction à CNOT7. On constate également que GFP-BTG4 co-précipite CNOT7, mais pas GFP ce qui confirme que les interactions constatées sont bien spécifiques des protéines BTG considérées (Figure R41b) comparer puits 17-18 et 19-20 respectivement).

Constatant que les protéines BTG3(V1) et BTG4 sont fonctionnelles par leur capacité à co- précipiter CNOT7, j’ai voulu mettre au point les conditions permettant une expression similaire de ces protéines et le domaine APRO de BTG2 avant de tester leur effet sur la désadénylation d’un rapporteur β-globine, étant donné que dans les expériences précédentes, GFP-BTG3(V1) et GFP- BTG4 étaient peu abondantes (Figure R40b). J’ai donc transfecté des cellules HEK293 Tet-Off avec des quantités croissantes des plasmides exprimant GFP-BTG3 et GFP-BTG4 et décroissantes du plasmide exprimant GFP-BTG2(A). Le western blot obtenu est présenté en Figure R42.

Figure R42 : Optimisation de l’expression de BTG2(A), BTG3 et BTG4 par transfection in

cellulo.

Des cellules HEK293 Tet-Off ont été transfectées avec diverses quantités de plasmides exprimant le domaine APRO de BTG2 (BTG2(A)), BTG3(V1) et BTG4 couplées à la GFP en N-terminal. La gamme de concentration pour GFP- BTG3(V1) et GFP-BTG4 est de 0,8 ; 1,6 et 2,4 μg, et de 0,2 ; 0,1 ; 0,05 et 0,025 μg pour GFP-BTG2(A). La présence des protéines d’intérêt a été observée par western blot après révélation avec un anticorps anti-GFP.

15 kDa 25 kDa 35 kDa 55 kDa 70 kDa M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 GFP-BTG2(A) GFP-BTG4 GFP-BTG3(V1)

On constate une légère augmentation de l’expression de GFP-BTG3(V1) et de GFP-BTG4 en fonction de la quantité de plasmide transfectée (puits 1-3 et 4-6, respectivement). Par contre, GFP- BTG2(APRO) n’est que faiblement détectable pour les quantités de plasmides utilisées (puits 7 et 8).

2.7.3 Évaluation de la capacité de BTG3 et BTG4 à induire la désadénylation d’un ARNm rapporteur par RACE-PAT :

En tenant compte de l’expérience précédente, des cellules HEK293 Tet-Off ont été transfectées avec une gamme croissante de quantités de plasmides exprimant GFP-BTG2(A) et avec une quantité fixe de plasmides exprimant soit GFP-BTG3 soit GFP-BTG4.

Figure R43 : Évaluation de la capacité de BTG3(V1) et BTG4 à affecter la désadénylation d’un rapporteur β-globine in cellulo.

(a) Des cellules HEK293 Tet-Off ont été co-transfectées avec un plasmide exprimant un rapporteur β-globine et diverses quantités de plasmides exprimant soit la GFP soit BTG2, BTG3 ou BTG4 couplées à la GFP en N-terminal et étiquetées HA en C-terminal pour BTG2. La gamme de plasmide transfecté pour GFP-BTG2(A) est de 0,2 ; 0,3 et 0,4 μg, tandis que les cellules exprimant GFP ont été transfectées avec 0,2 μg de plasmide et celles exprimant BTG3(V1) ou BTG4 avec 1,6 μg de plasmides. La présence des protéines d’intérêt a été observée par western blot après révélation avec un anticorps anti-GFP. Composition protéique représentative de deux réactions de transfection. (b) RT-PCR des queues poly(A) du transcrit rapporteur β-globine provenant des lysats cellulaires de l’expérience (a). Des fragments comprenant environ 200 nucléotides de l’extrémité 3’ de l’ARNm du transcrit β- globine ainsi que la queue poly(A) ont été amplifiés par RACE-PAT puis migrés sur gel d’agarose 3%. Les tailles moyennes des fragments (en nucléotides) sont d’environ 240 pour GFP, 232, 227 et 224 pour GFP-BTG2(A) (puits 2, 3 et 4 respectivement), 248 pour GFP-BTG3(V1) et 242 pour GFP-BTG4. Produits d’amplification représentatifs de deux réactions de transfection.

Sur le western blot effectué à partir des lysats cellulaires et présenté en Figure R43a), on constate une augmentation de l’expression de GFP-BTG2(A) en fonction de la quantité de plasmide transfectée (puits 2 à 4), tandis que les protéines de fusion GFP-BTG3 et GFP-BTG4 ont un niveau d’expression similaire à GFP-BTG2(A) pour la plus faible quantité de plasmide transfectée (Figure

25 kDa 35 kDa 55 kDa 70 kDa M 6 1 2 3 4 5 M 300 nts 200 nts Extrémité 3’ polyadénylée du rapporteur β-globine a) b) 6 1 2 3 4 5 400 nts

44a) comparer puits 2, 5 et 6). On constate également que, comme attendu, les queues poly(A) du rapporteur β-globine sont plus courtes pour les cellules sur-exprimant la protéine de fusion GFP- BTG2 que pour les cellules sur-exprimant uniquement GFP (Figure R43b) comparer puits 2-4 au puits 1), et l’on constate même une augmentation de la désadénylation en fonction de la quantité de plasmide transfectée pour GFP-BTG2(A). En effet, les tailles moyennes des fragments amplifiés du rapporteur β-globine (en nucléotides) sont d’environ 240 pour GFP et de 232, 227 et 224 pour GFP-BTG2(A) (puits 2, 3 et 4 respectivement). Cependant, on constate que les queues poly(A) des rapporteurs des cellules sur-exprimant GFP-BTG3 ou GFP-BTG4 sont de tailles similaires à celles retrouvées chez les cellules contrôles sur-exprimant GFP, avec des tailles moyennes (en nucléotides) d’environ 248 pour GFP-BTG3 et 242 pour GFP-BTG4 (Figure R43b) comparer puits 5 et 6 au puits 1). Ainsi, avec ces essais, on ne peut pas affirmer que BTG3(V1) et BTG4 activent la désadénylation d’un rapporteur β-globine in cellulo. Je ne peux cependant pas conclure sur l’absence d’effet de BTG3 et de BTG4 sur la désadénylation. Une technique plus résolutive permettant de visualiser la désadénylation d’un lot de rapporteurs invariant en nombre, comme la technique de pulse-chase transcriptionnel à partir de cellules HEK293 Tet-Off, pourrait être utilisée afin d’évaluer plus précisément le rôle de BTG3 et de BTG4 sur la désadénylation d’un rapporteur β-globine. Par ailleurs, il est possible qu’un ou plusieurs partenaire(s) protéiques de BTG3 et BTG4 ne soient pas présents dans les cellules utilisées pour les essais de RACE-PAT, empêchant ainsi de constater l’effet de BTG3 et BTG4 sur la désadénylation. Il pourrait donc être intéressant de réitérer ces expériences dans d’autres lignées cellulaires.

3 DISCUSSION :

3.1 BTG2(APRO) et PABPC1 sont capables d’interagir in cellulo, et cette interaction est