les matrices apicoles
3. Matériels et méthodes
3.5. Préparation d’échantillon
Cette partie résume les méthodes développées pour extraire les pesticides ciblés dans les échantillons d’abeilles, de pain d'abeille et de cire d'abeille. Les extractions des matrices abeilles et pain d’abeille ont été développées au sein de l'équipe TRACES avant le début de la thèse. Celle sur le pain d’abeille a fait l’objet d’une publications (96). L’optimisation de ces deux méthodes ne sera pas présentée dans ce manuscrit.
3.5.1. Les abeilles
La première étape consiste à ajouter dans un tube à centrifuger de 50 mL les abeilles (5 g) et les différents réactifs : 30 g de billes d'acier inoxydable (pour l'utilisation du Geno/Grinder®, (SPEX Sample Prep®, Metuchen, USA)), 3 mL d'eau, 3 mL d'hep-tane, 10 mL d'ACN à 2 % de TEA ainsi que 250 µL d'une solution d'étalons internes
à 100 µg.L-1 (imidaclopride-d4 et permethrine-d6). Une agitation par vortex est réali-sée pendant 10 sec, suivie de l'ajout du tampon citrate. Une forte agitation manuelle pendant 10 sec est effectuée afin d'éviter l'agglomération du sulfate de magnésium. Un broyage est ensuite réalisé à l'aide du Geno/Grinder® pendant 4 min à 1000 rpm. Puis une centrifugation à 5000 x g pendant 2 min permet de séparer les phases solide et liquide. Un volume de 8 mL de surnageant (phase ACN) est alors prélevé puis congelé à -18 °C pendant 12 heures minimum. Puis un prélèvement de 6 mL d'extrait est introduit dans un tube contenant la dSPE PSA/C18 suivi d'une agitation de 10 sec par vortex. Une centrifugation est ensuite réalisée à 5000 x g pendant 2 min per-mettant le prélèvement d'un volume de 4 mL d'extrait. Celui-ci est évaporé complè-tement à 40 °C sous flux d'azote. Une fois sec, le résidu est dissous dans 320 µL de MeOH. Un volume de 40 µL de cet extrait est prélevé puis introduit dans un vial dans lequel un volume de 160 µL d'eau est finalement ajouté avant l'analyse par UPLC-MS/MS.
3.5.2. Le pain d’abeille
La prise d'essai de pain d'abeille est de 2 g et se réalise dans un tube à centrifuger de 50 mL. De l'eau (5 mL), de l'heptane (5 mL) et de l'ACN (10 mL) contenant 2 % de TEA, sont ajoutés dans le tube. Un volume de 200 µL d'une solution d'étalons in-ternes à 100 µg.L-1 (imidaclopride-d4 et permethrine-d6) ainsi qu'un barreau en céra-mique (Agilent Technologies) sont ajoutés avant agitation du mélange par vortex pendant 15 sec. Le tampon acétate est alors ajouté dans le tube, qui est immédiate-ment agité manuelleimmédiate-ment pendant 10 sec afin d'éviter l'agglomération du sulfate de magnésium. Ensuite, une seconde agitation, de 20 sec, est réalisée par vortex dans le but d'homogénéiser l'échantillon. Après, le mélange subit une centrifugation à 5000 x g pendant 2 min. Cela permet la récupération d’un volume de 8 mL de surnageant (phase ACN) qui est ensuite congelé à -18°C pendant 15 heures. Un volume de 6 mL de l'extrait est ensuite transféré dans un tube de dSPE contenant 150 mg de PSA et 900 mg de sulfate de magnésium, puis agité à l'aide d'un vortex pendant 10 sec. Une nouvelle étape de centrifugation est alors réalisée (5000 x g, 2 min) qui permet de récupérer un volume de 4 mL d'extrait purifié. Puis l’extrait est évaporé à sec à 40 °C sous flux d'azote. Enfin, le résidu sec est dissous dans un volume de 400 µL de MeOH. Pour finir, 40 µL de MeOH sont ajoutés à un volume de 160 µL d'eau avant l'analyse par UPLC-MS/MS (d'après (96)).
3.5.3. La cire d’abeille
La cire (0,5 g) est introduite dans un flacon de verre de type Wheaton dans lequel sont ajoutés un volume de 4 mL de pentane ainsi que 250 µL d'une solution conte-nant les étalons deutérés imidaclopride-d4 et permethrine-d6 à 100 µg.L-1. Ce flacon est ensuite placé sous agitation dans un bain à ultrasons jusqu’à dissolution complète de la cire. Ce mélange est ensuite déposé dans un tube contenant 2,4 g de terre de diatomée préalablement réduite en poudre à l'aide du Geno/Grinder®. Un rinçage du flacon est effectué à l'aide de 4 mL de pentane, qui sont ensuite ajoutés au reste du mélange dans le tube à centrifuger. Ce tube est agité manuellement et par vortex dans le but de répartir de façon homogène le mélange de cire dissoute dans la poudre de terre de diatomée. Puis le pentane est éliminé par évaporation sous un faible flux d'azote, à température ambiante. Le résidu sec, mélange de terre de diatomée et de cire qui s'est alors recristallisée, est agité par vortex afin de parfaire l'homogénéité du mélange.
Un volume de 15 mL d'ACN acidifié (0,1 % d’acide formique) est ajouté dans le tube à centrifuger puis de fortes agitations manuelles puis par vortex sont réalisées. Une étape de centrifugation, à 5000 x g pendant 2 min (5°C), permet par la suite de récu-pérer le surnageant, c'est-à-dire l’ACN contenant les composés extraits. Un volume de 10 mL d'ACN est alors récupéré et mis de côté. Cette étape d'extraction est répétée une seconde fois avec 15 mL d'ACN. À l'issue de cette nouvelle extraction et centri-fugation, un volume de 15 mL est récupéré puis ajouté aux 10 mL précédents. Ce tube, contenant les 25 mL d'ACN issus de l'extraction, est stocké à une température de -18 °C pendant environ 15 heures.
Une centrifugation est alors réalisée à 5000 x g pendant 2 min (5°C) dans le but de regrouper tous les précipités de résidus de cire s'étant formés pendant les 15h. Ceci permet de prélever un volume de 10 mL d'ACN exempt de résidus de cire auxquels sont ajoutés 200 µL de DMSO. Après agitation par vortex (10 s), l'ACN est évaporé à 40 °C sous flux d'azote.
Une fois l'ACN évaporé, un volume de 1,8 mL d'un mélange eau/MeOH (80/20) est ajouté au DMSO. Après homogénéisation, 2 µL de ce mélange sont analysés par UPLC-MS/MS.