Détection par spectrométrie de masse

Les systèmes de détection pouvant être couplés à la LC et la GC sont variés et pos-sèdent des sensibilités spécifiques. Cependant, seule la détection par spectrométrie de masse (MS) est universelle pour une majorité de molécules et permet une grande sen-sibilité ainsi qu'une spécificité élevée, notamment lorsqu'elle est utilisée en tandem (MS/MS).

Cette technique de détection a l'avantage, comparé à d'autres types de détecteurs tels que les détecteurs optiques comme l'UV, d'apporter des informations structurales. En effet, en spectrométrie de masse, les rapports masse sur charge (m/z) et les produits de fragmentation sont obtenus, permettant de confirmer l'identité des composés ana-lysés (120). Ces qualités en font donc une technique de choix pour le développement de méthodes quantitatives de molécules présentes à de faibles concentrations. Elle est de ce fait devenue incontournable en analyse environnementale.

La spectrométrie de masse est une technique d’analyse qui permet l’identification et la quantification de composés organiques sur la base de la détermination de leurs masses moléculaires. Elle est fondée sur la séparation et la détection d’ions formés dans une source d’ionisation ou dans une cellule de collision, en fonction de leur m/z. Un spectromètre de masse est constitué de quatre éléments principaux :

- une source d’ionisation qui va permettre de produire les ions,

- un analyseur qui va séparer les ions produits en fonction du rapport m/z, - un détecteur qui convertit le courant ionique en courant électrique,

- un système de traitement informatique des données permettant d’obtenir un spectre de masse (intensités des ions en fonction de leur rapport m/z).

Plusieurs modes d'ionisation existent, dont les deux principaux lorsque couplés à la LC, sont l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) et l'ionisation élec-trospray (ESI). Notre étude faisant uniquement appel à l'utilisation de la source ESI, seul son principe sera présenté.

L'ionisation par ESI, dont le mécanisme est présenté dans la Figure II-3, est obtenue par application d'un fort courant électrique, sous pression atmosphérique, au liquide passant à faible débit (1 à 10 µL.min-1) dans un capillaire. Le courant est obtenu en appliquant une différence de potentiel (3 à 6 kV) entre le capillaire et une contre-électrode, séparés de 0,3 à 2 cm. Ceci créé un champ électrique qui engendre une ac-cumulation de charge à la surface du liquide se trouvant à la sortie du capillaire. Cette accumulation de charge entraîne la déformation du liquide qui se traduit par l'apparition d’un cône de Taylor, puis sa rupture par répulsion électrostatique et sa décomposition en gouttelettes chargées.

Un gaz, qui est injecté à faible débit et de façon co-axiale au capillaire, permet de limiter la dispersion du spray. Ces gouttelettes passent ensuite à travers un rideau de gaz inerte et chauffé, généralement de l'azote dirigé à contre-courant du trajet des ions, dans le but d'éliminer les dernières molécules de solvant.

Cette élimination du solvant cause un rétrécissement des gouttelettes et donc une augmentation de la charge par unité de volume, jusqu'à ce que la limite de Rayleigh soit atteinte. Cette limite correspond à la taille critique pour laquelle les répulsions coulombiennes entre les charges deviennent égales puis supérieures aux forces cohé-sives de la tension de surface du liquide. Les gouttelettes vont alors se déformer jus-qu'à se rompre en des gouttelettes plus petites. Ce phénomène se poursuit sur ces dernières, et ainsi de suite, jusqu'à ce que le champ électrique à leur surface soit assez important pour permettre la désorption des ions qu'elles contiennent.

Deux modes d'ionisation existent: le mode positif (ESI+) et le mode négatif (ESI-). En mode positif, le capillaire devient le siège d'oxydation où sont retenus les anions

tandis que les cations sont repoussés dans l'extrémité du cône de Taylor et inverse-ment en mode négatif.

Ces modes permettent de produire respectivement des ions chargés positivement ou des ions chargés négativement. La charge positive est souvent un adduit de proton (H+) mais peut aussi être un adduit de sodium (Na+), de potassium (K+) ou d'ammo-nium (NH4⁺). Il est conseillé, lorsque le mode positif est utilisé, de travailler en milieu acide (donneur de protons) en ajoutant de l'acide acétique par exemple ou encore en travaillant en présence d'acétate d'ammonium afin de favoriser les adduits de type [M+NH4]+.

Figure II-3 Ionisation ESI - Théorie (d'après (121))

Les ions ainsi formés sont ensuite acheminés vers l'analyseur en passant dans un premier compartiment qui est sous pression réduite et non plus sous pression atmos-phérique.

De la même façon que pour les sources d’ionisation, il existe une grande variété́ d’analyseurs. Notre étude sur la cire faisant uniquement référence à l'utilisation de l’analyseur triple quadripôle (QqQ), seul son principe sera présenté.

Le quadripôle utilise la stabilité des trajectoires pour séparer les ions selon leur m/z en fonction d'un champ électrique, combinaison d'une tension continue et d'une ten-sion alternative. Le système employé résulte de l'association de deux analyseurs

qua-dripolaires (Q1 et Q3) en série, séparés par une cellule de collision (q2) correspondant à un quadripôle plus court (Figure II-4). Ce système est appelé triple quadripôle (QqQ). Travailler avec un spectromètre de masse de ce type permet de travailler soit en MS simple, soit en tandem (MS/MS).

Figure II-4 Schéma d'un analyseur triple quadripôle

Dans le cas d’une analyse en mode MS simple, aucune tension alternative n’est appli-quée sur le troisième quadripôle, ce qui a pour conséquence de le rendre « transpa-rent » comme la cellule de collision. Deux modes d’analyses sont possibles : le mode balayage (full scan) où tous les ions formés sont observés, et le mode d’acquisition d’un rapport m/z donné (SIM, « Simple Ion Monitoring ») où certains ions formés sont sélectionnés.

Dans la configuration en tandem, les quadripôles (Q1 et Q3) sont « activés » et la cellule de collision est remplie de gaz inerte afin de fragmenter les ions sélectionnés par le premier analyseur (ion précurseur ou ion parent). Par ailleurs, l’analyse en tandem peut être menée selon différents modes de fonctionnement selon l’information recherchée :

- Mode descendant : l'ion parent est sélectionné en focalisant le premier analy-seur sur son rapport m/z. Les fragments formés dans la cellule de collision sont séparés par le deuxième analyseur et analysés. Le spectre obtenu présente à la fois l'ion parent et ses ions fragments (ions fils) ;

- Mode ascendant : le premier analyseur balaie une gamme de masse tandis que le deuxième est focalisé sur un seul rapport m/z. Tous les ions générés en source et capables de donner un fragment de même rapport m/z seront détec-tés ;

- Mode perte de neutre : les deux analyseurs balaient une gamme de masse si-multanément, mais avec un décalage de masse constant correspondant à la perte neutre suivie. Le spectre établi présentera alors tous les ions parents ca-pables de se fragmenter en générant un neutre de masse égale au décalage im-posé ;

- Mode « Multiple Reaction Monitoring » (MRM) (Figure II-5) : l'ion parent à étudier est sélectionné par le premier analyseur et fragmenté dans la cellule de collision, comme en mode descendant. En revanche, le second analyseur est fo-calisé sur l'ion produit. Ce mode de fonctionnement présente une double sélec-tivité à la fois de l'ion parent et de l'ion produit.

Figure II-5 Illustration du principe de fonctionnement du mode MRM (d'après (122))

Le mode d’acquisition sélectionné́ dans notre étude est le mode MRM. Il s’agit du mode de choix pour la quantification pour deux raisons. La première est la sélectivité́ (ion parent et ion(s) fils). La seconde est que ce mode permet de suivre précisément et simultanément les transitions MRM (ion parent => ion fils) de plusieurs ions pa-rents.

2.3. Performances analytiques et validation de méthodes