Modèle in vitro

3.2.1. Réactifs et solutions

Solutions mères

Pour le boscalide, le thiaclopride et le thiaméthoxame les substances actives pures ont été utilisées. Elles ont été commandées chez le fournisseur Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France) et ont une pureté supérieure à 99%. Les solutions sont préparées dans de l’eau à 1% d’acétone (pour thiaclopride et boscalide) et 2% d’acétone pour le thiaméthoxame. La concentration finale est de 100 µg.mL-1.

En revanche, pour la deltaméthrine et la lambda-cyhalothrine, en raison de leur faible solubilité dans l’eau, et en prenant en compte l'impossibilité d'utiliser une quantité importante de solvant organique pour les expériences in vitro, au risque de compro-mettre le matériel biologique, ce sont donc les produits commerciaux miscibles à l’eau qui ont été utilisés.

Pour la lambda-cyhalothrine le produit commercial utilisé est KarateXpress-Syngenta granule à 5% de substance active. En ce qui concerne la deltaméthrine, le produit commercial utilisé est Décis Protech-Bayer solution aqueuse à 15 g.L-1. Les solutions sont préparées dans de l’eau et la concentration finale en matière active est également de 100 µg.mL-1.

Réactifs

Les produits utilisés pour la préparation des différentes fractions cellulaires provien-nent de Sigma-Aldrich : phosphate de sodium, chlorure de magnésium, chlorure de potassium, glutathion, acide trichloroacétique, éthylène diamine tétra-acétique (EDTA), glucose-6-phosphate (G6P), glucose-6-phosphate déhydrogénase (G6PDH), ß-nicotinamide adénine dinucléotide phosphate hydrate (ß-NADP+), saccharose, phé-nyl méthyl sulfophé-nyl fluoride (PMSF), inhibiteur de trypsine, glycérol, cocktail d’inhibiteurs de protéases.

Milieux

Quatre milieux, trois pour la préparation de la fraction cellulaire microsomale (homo-généisation, re-suspension et métabolisation) et un pour la préparation de la fraction cellulaire cytoplasmique (homogénéisation), ont été nécessaires. Le Tableau III-1 pré-sente le détail de la composition de chaque milieu.

3.2.1. Protocole d’obtention des extraits in vitro

Prélèvement des abeilles

Les abeilles sont prélevées au rucher de l’Unité Mixte de Recherche Abeille et Envi-ronnement à l'INRA d'Avignon. Elles sont ensuite endormies au dioxyde de carbone et congelées à une température de -150 °C. La Figure III-5 illustre cette étape de pré-lèvement.

Tableau III-1 Composition des milieux pour l'obtention des fractions cellulaires

Fraction Milieu ^Composition

Composé Concentration Microsomale Homogénéisation Saccharose 250 mM Chlorure de magnésium 5 mM Chlorure de potassium 50 mM EDTA 0,1 mM PMSF 1 mM Inhibiteur de trypsine 0,1 mg/mL Cocktail inhibiteur / Resuspension Glycérol 20% Chlorure de magnésium 5 mM Chlorure de potassium 50 mM EDTA 0,1 mM Phosphate de sodium 100 mM Inhibiteur de trypsine 0,1 mg/mL Cocktail inhibiteur / Métabolisation Chlorure de magnésium 6,25 mM Phosphate de sodium 125 mM NADP+ 1,25 mM G6P 1,25 mM G6PDH 10 unités/mL Inhibiteur de trypsine 0,1 mg/mL Cocktail inhibiteur / Cytoplasmique Homogénéisation Chlorure de magnésium 5 mM Chlorure de potassium 50 mM Phosphate de sodium 100 mM

Récupération des abdomens

Une fois les abeilles congelées, elles sont déposées dans un flacon de verre préalable-ment refroidi (à - 20°C). Une forte agitation manuelle du flacon permet de rompre les liaisons entre les différentes parties du corps des abeilles et d'obtenir un mélange de : têtes, thorax et abdomens. Un premier tri est réalisé à l'aide d'un tamis et permet

d'éliminer les pattes, antennes et ailes, puis un tri manuel à l'aide de pinces est réali-sé afin de récupérer uniquement les abdomens. La Figure III-6 illustre ces étapes.

Figure III-6 Récupération des abdomens d'abeilles

Préparation de l’extrait d’abeille

Les abdomens sont ensuite pesés et ajoutés au milieu d'homogénéisation propre à chaque fraction cellulaire (cytoplasmique ou microsomale). La quantité d'abdomen représente 10 % (poids/volume) de la solution d'homogénéisation donc par exemple on ajoutera 250 mL de solution pour 25 g d'abdomens.

Une première étape de broyage est réalisée à l’aide d’un broyeur à lame. Le récipient du broyeur est maintenu dans un bain de glace. Ce dernier est ensuite filtré à l’aide d’un voile fin puis transvasé dans un broyeur de Potter de verre afin d’achever l'ho-mogénéisation. Le broyeur de Potter permet de rompre la paroi des cellules et ainsi d’en libérer le contenu (cytoplasme). Ces étapes sont présentées dans la Figure III-7.

Obtention des fractions cellulaires microsomale et cytoplas-mique

Les deux fractions cellulaires sont obtenues par centrifugations différentielles du broyat d'abeilles. Les centrifugations sont réalisées à 4 °C avec le rotor Kontron TFT 45.94 (Figure III-8).

Figure III-8 Centrifugation du broyat d'abeille en vue de l'obtention des différentes fractions cellulaires

- Obtention de la fraction microsomale :

A l’issue du broyage par le broyeur de Potter, une première centrifugation est réalisée à 30 000 g pendant 20 min. Cette première étape élimine les débris tissulaires, les noyaux, les fractions mitochondriales, lysosomales et membranaires. Le surnageant est récupéré pour subir une seconde centrifugation, celle-ci à 100 000 g pendant 60 min. Après cette étape, le surnageant est éliminé. Seul le culot microsomal est con-servé. Ce culot est ensuite rincé trois fois avec du milieu d’homogénéisation. Puis il est remis en solution avec du milieu de resuspension. Cette solution microsomale sera utilisée pour réaliser la première partie des expériences de métabolisation.

- Obtention de la fraction cytoplasmique :

La fraction cytoplasmique correspond au surnageant d'une seule étape de centrifuga-tion. Elle est réalisée à 12 000 g pendant 20 min et permet d’éliminer les débris tissu-laire, les noyaux, les fractions mitochondriales et lysosomales. Ce surnageant sera utilisé pour réaliser la seconde partie des expériences de métabolisation.

Activation et arrêt des réactions de métabolisation in vitro

La réaction de métabolisation est réalisée dans des tubes contenant les différentes solutions nécessaires aux réactions de métabolisation. Le Tableau III-2 liste les diffé-rentes solutions utilisées pour chaque métabolisme étudié, le microsomal et le cyto-plasmique. Les tubes sont ensuite placés sur une table d'agitation horizontale. Deux temps de métabolisation sont étudiés : T2 = 2 h et T6 = 6 h. Ensuite, la réaction

métabolique est arrêtée en mettant les tubes au congélateur à -80°C. Le stockage de ces extraits est ensuite réalisé à - 20°C jusqu'à leur analyse.

Tableau III-2 Composition des deux milieux de métabolisation in vitro : microsomal et cytoplasmique

Métabolisme microsomal Métabolisme cytoplasmique

Milieu d’incubation Suspension cytoplasmique

+ Pesticide + Pesticide

+ Suspension microsomale (+NADPH) + Avec/Sans glutathion

Préparation d’échantillon

En vue de l'analyse, une préparation d'échantillon par précipitation des protéines à l'aide d'un solvant organique est réalisée. Pour cela, de l’ACN est ajouté à l'extrait dans les proportions 70/30 ACN/extrait in vitro (v:v). La précipitation des protéines est donc réalisée avec 300 µL d'extrait auxquels sont ajoutés 700 µL d’ACN.

Ensuite une étape de centrifugation (13 000 x g, 15 min) permet de récupérer le sur-nageant exempt de protéines afin de réaliser l'analyse.