Echantillons et contrôles

Pour chaque modèle utilisé, in vitro et in vivo, les temps de métabolisation et les ré-pliquats conditionnent le nombre d'échantillons générés. Les temps de métabolisation ont été choisis afin de permettre une dégradation suffisante de la molécule mère. Les contrôles ont, quant à eux, été utilisés afin de ne pas détecter de faux-positifs.

Modèle in vitro

Temps de métabolisation

Deux temps de métabolisation ont été déterminés en concertation avec les éco-toxicologues de l’INRA (UMR 406, Avignon) qui avaient déjà observé, lors de précé-dentes expériences in vitro, de fortes diminutions de la concentration en molécule mère dès les premières heures. Ainsi, en plus du temps 0 (T0), des temps correspon-dant à 2h et 6h après la mise en contact ont été sélectionnés pour tous les pesticides étudiés.

Échantillons et contrôles

Deux types d'expériences in vitro ont été menées, afin d'accéder au maximum d'information sur la métabolisation des pesticides : métabolisme oxydatif, hydroly-tique et conjugatif au glutathion.

L'étude du métabolisme oxydatif (de phase I), est réalisée à l'aide des extraits micro-somaux. L'étude des métabolismes hydrolytique et conjugatif au glutathion sont, quant à eux, réalisés à partir des extraits cytoplasmiques auxquels a été ajouté (mé-tabolisme conjugatif), ou non (mé(mé-tabolisme hydrolytique), le glutathion.

Plusieurs contrôles ont également été réalisés pour chaque type d'extrait et sont pré-sentés dans le Tableau III-7. Certains extraits, dont le matériel biologique (fraction microsomale et fraction post-mitochondriale) a été désactivé par chauffage à 100 °C pendant 5 min et auxquels sont ajoutés les pesticides étudiés, constituent le premier contrôle. Ils permettent d'avoir un échantillon contrôle dans lequel le pesticide a subi les deux temps de métabolisation mais dont la potentielle dégradation n’est pas due à des réactions métaboliques. Le second contrôle correspond au matériel biologique au-quel aucun pesticide n’a été ajouté aux deux temps de métabolisation (T2 et T6) ain-si qu’à T0.

Tableau III-7 Composition des extraits in vitro pour l’expérience de métabolisation

Extraits cytoplasmiques

Extraits microsomaux AVEC glutathion SANS glutathion

Extraits de métabolisation

T0, T2 et T6

Suspension cyto. Suspension cyto. Suspension micro.

+ Pesticides + Pesticides + Pesticides

+ Glutathion + Eau + Milieu de métabolisation

Contrôles

Extraits inac-tivés T0, T2 et T6

Suspension cyto. inactive Suspension cyto. inactive Suspension micro. inactive

+ Pesticides + Pesticides + Pesticides

+ Glutathion + Eau + Milieu de métabolisation

Extraits sans pesticides T0, T2 et T6

Suspension cyto. Suspension cyto. Suspension micro.

+ Glutathion + Eau + Eau

Modèle in vivo

Temps de métabolisation

Le temps de métabolisation in vivo a été choisi à partir des cinétiques de dégradation obtenues par Y. Poquet (161) au cours de ses travaux au sein de l'équipe Abeille et Environnement, et présentées dans la Figure III-18 pour les molécules de thiaclopride, thiaméthoxame et deltaméthrine.

Ces graphes montrent qu'une forte diminution (80%) de la concentration en molécule mère est observée au cours des premières 24 heures, pour chacune des trois molécules. Compte tenu de ces résultats, des résultats des mortalités induites chez les abeilles présentées précédemment (4.1.2), il a été décidé d'effectuer les expériences de métabo-lisation sur une durée de 24h.

Échantillons et contrôles

Plusieurs contrôles, exempts de pesticides, ont été réalisés. Le premier correspond aux abeilles congelées juste après leur prélèvement dans la ruche et leur endormissement. Le second correspond à des abeilles ayant subi l'étape de pulvérisation mais avec de l'eau distillée. Ce contrôle permet de reproduire le stress, et donc les changements physiologiques, subis par les abeilles au cours de la pulvérisation. Elles ont ensuite été, soit congelées immédiatement après la pulvérisation (T0), soit conservées (vi-vantes) à l'étuve pendant la durée de l'étude (T24). Tous les échantillons et contrôles

in vivo ont été réalisés en duplicat. Un contrôle supplémentaire a consisté à vérifier

l'absence de métabolites dans les solutions commerciales. Les échantillons et contrôles ayant été réalisés dans le cadre de l'étude de la métabolisation in vivo sont regroupés dans le Tableau III-8.

Tableau III-8 Composition des échantillons d'abeilles pour l'expérience de métabolisa-tion in vivo

Nom du contrôle Composition

Contrôle Pesticide T0 Solution de pulvérisation

Contrôle Pesticide T24 ^{Solution de pulvérisation ayant subi une période de 24h} dans une étuve à 28 °C

Contrôle Blanc ruche abeilles congelées après le prélèvement dans la ruche

Contrôle Blanc T0 ^{abeilles ayant subi une pulvérisation d'eau distillée puis} une congélation juste après (T0)

Contrôle Blanc T24

abeilles ayant subi une pulvérisation d'eau distillée et une mise à l'étuve pendant 24h (T24) avant la

congéla-tion

Échantillon Pesticide T0 ^{abeilles ayant subi la pulvérisation d'une molécule} étu-diée et une congélation immédiate (T0)

Échantillon Pesticide T24

abeilles ayant subi la pulvérisation d'une molécule étu-diée et une mise à l’étuve pendant 24h, avant d'être

Les chromatogrammes reconstitués (EIC) des molécules mères obtenus à l'issue de l'analyse de ces solutions sont présentés en Annexe 4. Des flèches indiquent les pics chromatographiques correspondant aux substances actives. Ces analyses révèlent la présence dans certaines solutions commerciales, comme par exemple celles de la del-taméthrine et du thiaméthoxame, de nombreux composés en plus des substances ac-tives, correspondant certainement aux différents adjuvants présents dans les formula-tions.

Les solutions de pulvérisation ont également été analysées après 24 h à l’étuve afin de vérifier qu'elles ne se dégradent pas éliminant ainsi l'hypothèse selon laquelle les mé-tabolites suspectés sont issus de dégradations physico-chimiques pendant les 24h à l'étuve.

4.1.4. Préparation d’échantillon

Modèle in vitro

Les extraits in vitro sont des échantillons peu complexes par rapport aux matrices apicoles étudiées dans le chapitre précédent. Cependant ils contiennent des protéines pouvant perturber la détection des métabolites recherchés. Pour cette raison, une préparation d'échantillon est nécessaire afin d'éliminer ces protéines.

Pour cela, la technique de précipitation par ajout de solvant organique (ACN) a été employée car cela ne dénature pas les composés recherchés, contrairement à l’ajout d’acide.

Modèle in vivo

L'extraction des métabolites dans les abeilles a été effectuée par la même extraction QuEChERS que celle reporté au chapitre précédent (3.5.1).

Cependant, dans le but de favoriser la détection des métabolites par ToF, deux pa-ramètres ont été optimisés : la nature du solvant d'injection ainsi que la nature de la phase de purification.

Composition de l’extrait injecté

Le protocole d'origine consistait en l'injection d'un extrait (MeOH) dilué (x 5) avec de l'eau. Si cela permettait de se placer dans les conditions de début de gradient, cette dilution n'est pas bénéfique dans la problématique de recherche de métabolites puisqu'elle diminue les concentrations.

Des tests ont donc été effectués pour permettre la comparaison d'un extrait dilué (x 5), selon le protocole d'origine, avec un extrait non dilué (100% MeOH), ainsi qu'avec un extrait dilué (x 5) puis filtré afin d'enlever de potentiels résidus lipidiques.

L'évaluation de ces différents paramètres est réalisée par enrichissement des abeilles avec une solution contenant les 5 pesticides étudiés, à une concentration de 10 mg.L-1. Les chromatogrammes reconstitués des EIC des cinq pesticides étudiés sont présentés (Figure III-19) avec la même échelle d'intensité.

a)

b)

c)

Figure III-19 Chromatogramme reconstitué avec les EIC des cinq pesticides étudiés d'un extrait obtenu par le protocole original d'extraction des abeilles (a) dilué par 5,

La comparaison des deux premiers chromatogrammes montre que l'étape de filtration entraine une diminution d'intensité du pic chromatographique correspondant au bos-calide, et une perte des deux pyréthrinoïdes. L'étape de filtration ne sera donc pas conservée pour les futures analyses.

La comparaison des chromatogrammes a) et c), montre que les cinq molécules sont bien présentes et que l’intensité des pics chromatographiques est doublée (thiaclo-pride, boscalide et deltaméthrine) voire quintuplée (lambda-cyhalothrine) lorsque l’extrait n’est pas dilué. En ce qui concerne le thiaméthoxame, l'intensité de son pic chromatographique a également augmenté, mais il présente un dédoublement en rai-son de la nature organique de l'extrait injecté et de la composition majoritairement aqueuse de la phase mobile du début de gradient.

L'objectif étant de privilégier la sensibilité afin de détecter les métabolites, le choix s'est porté sur l'injection de l'extrait non dilué dont la composition est organique (MeOH), qui permet un gain d'intensité jusqu'à un facteur 5 (lambda-cyhalothrine).

Nature de la phase de purification

Deux nouvelles phases de dSPE, Z-Sep et Z-Sep+, contenant du zirconium, ayant ré-cemment été commercialisées pour améliorer la purification des extraits contenant des lipides, ont été évaluées.

La phase Z-Sep correspond à une phase de silice greffée avec des oxydes de zirconium. En revanche, la phase Z-Sep+ correspond à une phase de silice greffée à la fois avec des oxyde de zirconium et des chaînes alkyle C18. Les tests ont été réalisés en utili-sant les phases Z-Sep et Z-Sep+ à la place de la phase PSA/C18 du protocole d'ori-gine.

Les résultats issus de l'utilisation de ces deux phases ont donc été comparés à ceux issus de l'utilisation de la phase PSA/C18. La première différence observée est une coloration moins prononcée de l'extrait purifié avec la phase Z-Sep+ par rapport au deux autres (Figure III-20).

Figure III-20 Différences de coloration des extraits obtenus après extraction d'abeilles et purification par trois phases : PSA/C18 (Q), Z-sep et Z-sep+

La phase Z-Sep+ semble retenir plus de composés, notamment ceux à l'origine de la coloration jaune des extraits provenant peut-être du contact entre la cire et les pol-lens et/ou la propolis.

L'analyse de ces extraits par LC-QqQ a permis de comparer les aires des pics chro-matographiques des cinq pesticides dans ces trois extraits (Figure III-21).

Figure III-21 Résultats (aires) de l'analyse des 5 pesticides après extraction des abeilles suivie d’une purification par les trois phases testées : PSA/C18, Sep et

Z-Sep+