Tableau I-1 Toxicité aiguë (DL50 contact et orale sur 48h) des pesticides étudiés sur les abeilles (Apis mellifera), d'après (76) ... 33 Tableau II-1 Gradient appliqué pour l'analyse LC des 13 pesticides ... 65 Tableau II-2 Temps de rétention (tR), transitions de quantification (MRM1) et de confirmation (MRM2) et paramètres de sources pour l’identification et la détection des 13 pesticides par UHPLC-MS/MS ... 66 Tableau II-3 Concentrations de la courbe de calibration (ng/g) ... 68 Tableau II-5 Limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) pour les 13 pesticides, dans les trois matrices d'intérêt : abeilles, cire et pain d'abeille ... 86 Tableau II-6 Comparaison (nombre et concentration en ng.g-1) des résultats de la contamination des abeilles, cire et pain d’abeille par l'imidaclopride, la clothianidine et le thiaméthoxame, avant et après la restriction de leur usage en 2013 ... 96 Tableau III-1 Composition des milieux pour l'obtention des fractions cellulaires ... 114 Tableau III-2 Composition des deux milieux de métabolisation in vitro : microsomal et cytoplasmique ... 117 Tableau III-4 Gradient appliqué pour l'analyse LC des extraits in vitro et in vivo .. 124 Tableau III-5 Temps de rétention, transitions de quantification (MRM1) et de confirmation (MRM2) et paramètres de source pour le boscalide et les cinq étalons synthétisés, par LC-QqQ ... 130 Tableau III-6 Nombre de métabolites connus répertoriés dans la littérature pour chacun des pesticides étudiés ... 132
Tableau III-7 Composition des extraits in vitro pour l’expérience de métabolisation139 Tableau III-8 Composition des échantillons d'abeilles pour l'expérience de métabolisation in vivo ... 141 Tableau III-9 Domaines de masse réduits du ToF ... 147 Tableau III-10 Variation (%) d'intensité des ions parents des pesticides étudiés, dans les extraits in vitro entre les temps T0 et T6, par LC-QqQ ... 151 Tableau III-11 Diminution (%) d'intensité des ions parents dans les extraits in vivo entre les temps T0 et T24 par LC-ToF ... 155 Tableau III-12 Liste des métabolites connus détectés dans les échantillons in vivo (T24) ... 155 Tableau III-13 Rapport m/z et temps de rétention de métabolites potentiels obtenus à l’issu de la recherche de métabolites chlorés, bromés et/ou soufrés, non répertoriés165 Tableau III-15 Récapitulatif des analyses de fragmentation des métabolites BoscaMet359Px (P1 à P4) et BoscaMet375 ... 171 Tableau III-16 Comparaison des fragments générés par les différents métabolites avec ceux générés par le boscalide ... 172 Tableau III-17 Récapitulatif des métabolites et des marqueurs d'exposition du boscalide identifiés chez l’abeille et dans la solution de pulvérisation au cours des expériences in vivo ... 176 Tableau III-18 Récapitulatif des analyses de fragmentation du thiaclopride et de ces potentiels métabolites de m/z 237,05 Da et 269,02 Da ... 178 Tableau III-19 Comparaison des fragments générés par les deux métabolites (m/z 237,05 Da et 269,02 Da) avec ceux générés par le thiaclopride ... 179 Tableau III-20 Récapitulatif des métabolites m/z 237,05 Da et 269,02 Da du thiaclopride identifiés chez l’abeille au cours des expériences in vivo ... 179 Tableau III-21 Fragments issus de l'analyse QqToF du thiaméthoxame et de son potentiel métabolite 253 ... 181 Tableau III-22 Fragments issus de l’analyse QqToF de la deltaméthrine et de son potentiel métabolite 438 ... 183 Tableau III-23 Tableau bilan : identité des métabolites de pesticides chez les abeilles184 Tableau III-24 Concentrations en boscalide, en métabolite DIV1 et en marqueurs d'exposition DIV2, DIV3, DIV4 et DIV5 dans des échantillons d'abeilles provenant de ruchers symptomatiques ... 186
Les exigences grandissantes du secteur alimentaire, l'augmentation de la population et le développement de cultures non-alimentaires (biofuel, matériaux biodégradables, tissus, ...) ont entrainé de profonds changements dans la gestion des systèmes agri-coles au cours du siècle dernier. Ces changements se traduisent notamment par le besoin de contrôler les phénomènes pouvant nuire aux récoltes, tels que le dévelop-pement et la prolifération de certaines maladies ou ravageurs. Ainsi, l'utilisation des pesticides est devenue incontournable afin de garantir les rendements de production et d'optimiser la qualité des produits cultivés.
Cependant leurs potentiels impacts sur l'environnement (pollution de l'air, des sols, des eaux de surface et souterraines, atteinte de la biodiversité de la faune et de la flore, ...) et sur la santé humaine (cancers, troubles de la reproduction, ...) ont généré une forte préoccupation sociétale et un changement de politiques visant une réduction des risques et des usages des pesticides. De nouvelles molécules agissant à de faibles doses à l’hectare ont été commercialisées et permettent de réduire les quantités utili-sées. Malheureusement, ces produits n’en sont pas moins toxiques et leurs impacts latéraux ne sont pas clairement établis.
Un des impacts environnementaux lié à l'utilisation de pesticides est la disparition des insectes pollinisateurs responsables de la reproduction de la majorité des plantes à fleurs. Environ 35 % de la production mondiale de nourriture résulte de cultures dé-pendant directement des pollinisateurs (1).
Parmi ces insectes pollinisateurs, l'abeille joue un rôle prépondérant dans la produc-tion agroalimentaire. Cependant, elle est sujette, depuis une vingtaine d'années, à des mortalités importantes qui sont maintenant connues comme étant multifactorielles : facteurs épidémiologiques (parasites, maladies), facteurs génétiques, facteurs environ-nementaux (climat, cultures) et facteurs chimiques (pesticides) (2).
Les travaux présentés dans ce manuscrit se concentrent sur les facteurs chimiques, et plus particulièrement sur l’analyse de 13 pesticides et métabolites dans l’abeille et deux matrices apicoles, la cire et le pain d’abeille.
Ils font suite à une précédente étude menée au laboratoire (3), qui avait révélé la pré-sence récurrente de certaines familles de pesticides au sein des ruchers français (abeille, pollen, miel) telles que les néonicotinoïdes et les pyréthrinoïdes.
De plus, cette étude avait mis en lumière le besoin d’analyser d’autres matrices api-coles telles que la cire, continuellement réutilisée par les apiculteurs, et le pain d’abeille, qui représente la seule source de nourriture pour les abeilles durant les mois d’hiver. Toutes deux constituent de potentielles sources de contamination des abeilles
par contact et/ou ingestion. Le pain d’abeille est, de surcroit, une matrice pouvant être utilisée comme indicateur de la contamination de l’environnement des ruchers puisqu’il est constitué des pollens récoltés par les butineuses autour de la ruche.
Du fait de la métabolisation des pesticides par l’abeille, l’étude avait également mon-tré la nécessité d’identifier les métabolites majeurs des pesticides ciblés et de les in-clure aux méthodes multi-résidus. En effet, la formation de métabolites chez l’abeille, potentiellement plus toxiques que la molécule mère, est encore peu documentée et leur prise en compte pourrait contribuer à l’étude des risques liés à l’utilisation des substances actives.
Dans ce contexte, ces travaux de thèse ont donc pour objectifs :
< De développer une méthode d’extraction de 13 pesticides et métabolites dans la cire d’abeille
< D’appliquer la méthode développée à des échantillons de cire, issus de divers ruchers français, fournis par des apiculteurs appartenant aux deux organismes apicoles FNOSAD et ADARA
< De compléter l’état des lieux par l’analyse d’abeilles et pain d’abeille prove-nant des mêmes ruchers
< D’élaborer et mettre en place une stratégie analytique de détection et identifi-cation de métabolites basée sur l’utilisation de la spectrométrie de masse à haute résolution
< D’identifier des métabolites, à partir d’expérimentations in vitro et in vivo, grâce à la collaboration avec l’équipe Abeilles et Environnement de l’INRA d’Avignon
< De quantifier les métabolites ainsi identifiés dans des abeilles issues de ruchers symptomatiques sur le territoire français
Le Chapitre I présente les trois matrices d’intérêts (abeille, pain d’abeille et cire), les trois familles de pesticides auxquelles appartiennent les 13 molécules ciblées (néonico-tinoïdes, pyréthrinoïdes et carboxamides), et les données toxicologiques disponibles relatives aux abeilles.
Le Chapitre II présente le développement analytique réalisé pour la cire d’abeille, les résultats d’analyses obtenus pour les trois matrices étudiées, et discute ces résultats à l’aide des données fournies par les apiculteurs.
Enfin, le Chapitre III expose la stratégie analytique, la méthodologie et les résultats obtenus pour l’identification de métabolites de certains des pesticides étudiés.
Une conclusion générale permet de dresser un bilan du travail et d’ouvrir sur des perspectives.
Introduction
Chapitre II
Analyses ciblées de traces de pes-ticides dans les matrices apicoles
Chapitre III
Détection et identification de mé-tabolites chez les abeilles
Conclusions générales et perspectives
Chapitre I
Contexte global de l’étude