III.B.3) Analyses statistiques
IV. C.1) La plasticité glomérulaire est indépendante de la transcription
# Nous testons ici la possibilité que les modifications glomérulaires développées par les animaux conditionnés (cf. Chapitre 2) soient dépendantes dʼune vague de transcription pendant la phase de consolidation. Puisque nous avons montré au chapitre 1 que le blocage de la MLTt est maximal en injectant lʼinhibiteur de transcription 3 h après le conditionnement, nous avons voulu tester lʼeffet dʼune telle inhibition sur la plasticité glomérulaire. Pour cela, une solution dʼactinomycine D a été injectée aux insectes 3 h après un conditionnement au 1-nonanol (cf. Matériels et Méthodes, III.A.3)). Ce groupe
conditionné ActD, est comparé à deux groupes contrôles : pseudoconditionnés (contrôle négatif) et conditionnés (contrôle positif), préparés dans les mêmes conditions quʼau chapitre 2.
# Nous avons dʼabord vérifié que les 199 animaux dédiés à cette expérience montraient des performances comportementales comparables à celles établies au chapitre 1 pour de telles procédures (annexe 6). Les groupes conditionné et conditionné ActD apprennent efficacement lʼassociation SC-SI, atteignant des pourcentages de réponses conditionnées dʼenviron 75-80 %. À lʼopposé, les réponses du groupe pseudoconditionné nʼévoluent pas pendant la phase dʼacquisition (∼ 5-10 %). Puis, au test de rappel, seules les abeilles conditionnées conservent un pourcentage de réponses spécifiques élevé (60 %), significativement supérieur aux abeilles des groupes pseudoconditionné et conditionné ActD (∼ 5-25 %) (test du χ2 : χ2 = 34.9, 1 ddl, P < 0.01). Concernant les groupes conditionnés et pseudoconditionnés, la sélection des individus en vue de lʼanalyse volumétrique est faite comme précédemment : sont retenus les 49 individus conditionnés répondant uniquement au SC (soit 60 %) et les 37 abeilles pseudoconditionnées ne répondant à aucune stimulation olfactive (soit 92 %). Pour les conditionnés ActD, étant donné que nous recherchons un effet de lʼactinomycine D sur la plasticité glomérulaire en lien avec le blocage de la consolidation, nous avons sélectionné les individus ayant correctement appris lʼassociation SC-SI, mais ne montrant aucune réponse au test de rappel de 72 h (cʼest-à-dire 32 des 78 abeilles du groupe). Les cerveaux de ces individus sont préparés pour lʼestimation du volume des 17 mêmes glomérules quʼau chapitre 2 (cf. Matériels et Méthodes).
# Nous avons ensuite voulu vérifier que nous retrouvions — comme au chapitre 2 (fig. 27A) — lʼeffet du conditionnement sur les volumes glomérulaires. La figure 32 présente la comparaison des volumes mesurés pour les groupes pseudoconditionnés et conditionnés. Le volume total (fig. 32A) — correspondant à la somme des volumes des 17 glomérules, soit environ 500 000 μm3 — ne montre pas de différence significative entre les 2 groupes (test U de Mann-Whitney, U = 464, NS). Cependant, notons que comme au chapitre 2 les conditionnés ont tendance à avoir un volume total plus important que les pseudoconditionnés. À lʼéchelle glomérulaire (fig. 32B), les volumes des glomérules des conditionnés et pseudoconditionnés montrent le même profil que le lot de données du chapitre 2. Dʼailleurs, lʼanalyse de ces nouvelles données avec une ANOVA semblable à
celle utilisée au chapitre 2 — intégrant les 2 facteurs procédure et glomérule — tend à montrer la même augmentation du volume de certains glomérules chez les conditionnés (interaction procédure x glomérule: F(16, 544) = 1.60, P = 0.06).
Figure 32 : Variation des volumes glomérulaires absolus en liaison avec la formation d’une MLTt pour le 1-nonanol. (A) Le volume des 17 glomérules est reconstruit à partir d’images de microscopie confocale de cerveaux marqués au rouge neutre (cf. Matériels et Méthodes ; cf. encadré en haut). Le volume
total moyen (± erreur standard) ne diffère pas significativement entre individus pseudoconditionnés et
conditionnés (test U de Mann-Whitney, U = 464, NS). (B) Les volumes absolus de chaque glomérule tendent
à être différents selon la procédure (ANOVA à 2 facteurs, interaction procédure x glomérule : F16, 544 = 1.60, P = 0.06).
Ce résultat en limite de significativité est renforcé par une corrélation très significative entre les variations des volumes glomérulaires de ces 2 expériences indépendantes (annexe 7) (R2 = 0.547, P < 0.001). Bien quʼétant environ 2 fois plus importantes lors de la première expérience, les variations de volume se répartissent de la même manière — parmi les 17 glomérules — dans les 2 expériences. Pour nous affranchir des variabilités interindividuelles relativement importantes qui pourraient nuire à la sensibilité de lʼANOVA, nous avons normalisé pour le volume de chaque glomérule par rapport au volume total des 17 glomérules mesurés dans le même lobe. Les volumes relatifs des 17 glomérules apparaissent en figure 33. Les groupes conditionné et pseudoconditionné sont comparés par une ANOVA à 2 facteurs (procédure et glomérule), qui montre une interaction significative (F(16, 544) = 1.73, P < 0.05). Il existe donc bien un effet du conditionnement sur le volume relatif de certains glomérules de la face rostro-ventrale des lobes antennaires. Nous détectons un effet procédure significatif pour les glomérules 23 et 48 (test t post- hoc : t > 2.8, P < 0.05). Le glomérule 23 montre une diminution de son volume relatif alors que le volume relatif du 48 est augmenté.
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# Afin de pouvoir comparer ce résultat avec les données du chapitre 2 (fig. 27A), ces dernières, précédemment examinées sous forme de volumes absolus, ont également été normalisées au volume total des 17 glomérules (annexe 8). On retrouve, dans ce cas également, des modifications de volume hétérogènes parmi les 17 glomérules étudiés (ANOVA à 2 facteurs, interaction procédure x glomérule : F(16, 400) = 2.43, P < 0.01), affectant préférentiellement les glomérules 17 et 48 (test t post-hoc : t > 2.6, P < 0.05). Pour ces 2 expériences indépendantes, les patrons de glomérules montrant une modification de volume significative semblent donc chevauchants (le glomérule 48 est affecté dans les 2 cas), mais non identiques. Comme pour les volumes absolus, nous avons vérifié si les modifications relatives des 17 glomérules, détectées par lʼANOVA dans les deux expériences, sont réparties de manière équivalente. En dʼautres termes, un glomérule est-il affecté par la même magnitude de variation de volume dans ces 2 expériences indépendantes ?
Figure 33 : Variations de volumes glomérulaires relatifs en liaison avec la formation d’une MLTt pour le 1-nonanol. Le volume de chaque glomérule est normalisé par rapport au volume total des 17 glomérules chez le même individu. Ces volumes relatifs moyens (± erreur standard) sont significativement différents entre abeilles conditionnées et pseudoconditionnées (ANOVA à 2 facteurs, interaction procédure x
glomérule : F16, 544 = 1.73, P < 0.05), spécifiquement au niveau des glomérules 23 et 48 (test t post-hoc : t >
Les modifications de volume observées dans les 2 expériences (représentés sous forme de cartes en figure 34A) montrent une corrélation positive significative (fig. 34B, R2 = 0.334, P < 0.05). Les changements de volume se répartissent donc de manière similaire dans ces 2 expériences indépendantes. À titre dʼexemple, les glomérules 17, 23, 33 et 48 montrent les modifications de volumes les plus importantes, supérieures à 0.4 % de leurs volumes relatifs, dans les 2 expériences. À lʼopposé, les glomérules 29 et 49 montrent les variations de volume les plus faibles dans les 2 expériences (fig. 34A).
Figure 34 : Les variations de volumes relatifs accompagnant la formation de la MLTt pour le 1- nonanol sont similaires dans deux expériences indépendantes. (A) (à gauche) La position des 17 glomérules étudiés est rappelée sur l’atlas du lobe antennaire gauche. (à droite) Les pourcentages de modification des volumes glomérulaires (pour chaque glomérule, en volume relatif : Volume Conditionnés -
Volume Pseudoconditionnés) sont reportés sur la carte du lobe antennaire, à l’aide d’un code en fausses couleurs.
(B) Ces variations de volume glomérulaire sont corrélées avec celles correspondant aux données du chapitre 2 (annexe C3). Nous détectons une corrélation positive significative (r = 0.73, P < 0.001). (# : P < 0,05, test t post-hoc ; * : P < 0.05.)
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# Pour tester si cette plasticité développée par les abeilles conditionnées est liée à la synthèse dʼARN, le groupe conditionné ayant reçu de lʼactinomycine D (conditionnés ActD) est pris en compte dans les comparaisons (fig. 35). Une ANOVA à 2 facteurs (procédure et glomérule) est appliquée aux mesures des 3 groupes : pseudoconditionné, conditionné ActD et conditionné. Nous détectons une interaction entre les facteurs procédure et glomérule très proche de la significativité (F(32, 880) = 1.38, P = 0.08), reflétant sans doute, au moins en partie, les différences de volumes glomérulaires entre pseudoconditionnés et conditionnés (cf. plus haut ; ANOVA à 2 facteurs, interaction procédure x glomérule : F16, 544 = 1.73, P < 0.05). Pour savoir si les individus conditionnés ActD montrent des volumes glomérulaires différents de ceux des individus conditionnés, ces 2 groupes ont été comparés directement à lʼaide dʼune ANOVA à 2 facteurs. Nous ne détectons aucun effet significatif de la procédure elle-même, ni dʼinteraction significative procédure x glomérule (F < 0.77, NS) . Le blocage de la transcription nʼa donc pas dʼeffet global sur les volumes glomérulaires mesurés. À lʼéchelle glomérulaire (fig. 35), on vérifie bien que les volumes des glomérules 23 et 48 ne différent pas entre groupes conditionnés et conditionnés ActD (t < 0.39, 35 ddl, NS). En accord avec ces analyses, la comparaison des volumes glomérulaires des pseudoconditionnés et des conditionnés ActD montre une interaction procédure x glomérule en limite de significativité (F16, 656 = 1.64, P = 0.054). Les volumes glomérulaires ont donc tendance à différer entre pseudoconditionnés et conditionnés ActD, comme ils diffèrent entre pseudoconditionnés et conditionnés.
" Ces résultats indiquent que la plasticité structurale glomérulaire associée à la MLTt est indépendante de la transcription 3 h après lʼapprentissage.
Figure 35 : La plasticité structurale glomérulaire liée à la MLTt ne dépend pas de la transcription. (A) Le volume des 17 glomérules est reconstruit à partir d’images de microscopie confocale de cerveaux marqués au rouge neutre (cf. Matériels et Méthodes). Leurs volumes relatifs (normalisés en fonction du volume total des 17 glomérules du même lobe) sont comparés entre groupes pseudoconditionnés,
conditionnés ActD et conditionnés au 1-nonanol. L’augmentation du volume de certains glomérules, liée au
développement d’une MLTt chez les individus conditionnés (pseudoconditionnés vs conditionnés, ANOVA 2 facteurs : interaction procédure x glomérules, F(16, 544) = 1.73, P < 0.05) n’est pas bloquée par le traitement
ActD (conditionnés ActD vs conditionnés, ANOVA à 2 facteurs : interaction procédure x glomérule, F(16, 560)