PfI2

Le dernier régulateur identifié et caractérisé est l’inhibiteur 2 (PF3D7_0320000), une protéine thermostable de 144 acides aminés, avec un poids moléculaire de 16,7kDa. C’est le plus petit inhibiteur 2 identifié à ce jour. En effet, les séquences protéiques d’I2 varient entre 164 et 205 acides aminés. Chez le parasite, un seul gène code pour ce régulateur, qui a une homologie d’environ 28% avec les autres inhibiteurs 2. Contrairement à son homologue humain, qui possède 3 motifs d’interaction : KGILK, RVXF et HYNE, PfI2 n’en possède que 2, le motif RVxF, dans une partie non structurée en N-terminal, et le motif HYNE, au niveau d’une hélice α en C-terminal (Fréville et al. 2013).

Des études de génétique inverse (réalisation d’un Knock-Out) ont montré que PfI2 est essentiel au niveau du cycle érythrocytaire pour la survie du parasite. De plus, sa localisation est nucléocytoplasmique, comme la protéine PfPP1, ce qui suppose une régulation de l‘enzyme à différents niveaux par l’inhibiteur 2 (Fréville et al. 2013).

Différentes approches (test de type ELISA, double hybride en levure) ont montré une interaction entre I2 et PP1 de P. falciparum. Des délétions ou des mutations des motifs d’interaction ont été effectuées. L’analyse des résultats montre une interaction entre les protéines PfPP1 et PfI2 (sauvage, mutée ou délétée). De plus, PfI2 interagit avec la PP1 de Xénope (Fréville et al. 2013).

Différentes approches ont montré que PfI2 pouvait inhiber jusqu’à 80% l’activité de PP1. La mutation ou l’absence du motif HYNE entraîne une diminution de la fonction régulatrice de PfI2 alors que pour le motif RVxF, une perte totale de la fonction est observée.

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Ces résultats ont été confirmés en modèle d’ovocytes de Xénope. En effet, l’injection des protéines mutées sur le motif HYNE ou RVxF entraîne une faible maturation des ovocytes, suggérant une perte partielle ou totale de la fonction de PfI2, alors que l’interaction est conservée (Fréville et al. 2013).

Des peptides dérivés du motif RVxF ou du motif HYNE de PfI2 ont été utilisés en modèle d’ovocytes de Xénope ou sur une culture de P. falciparum. Il a été montré que les peptides bloquent la fonction régulatrice de PfI2 en ovocytes. De plus, le peptide dérivé du motif RVxF inhibe la croissance parasitaire alors que celui du motif HYNE n’a pas d’effet (Fréville et al. 2013).

Toutes ces informations suggèrent donc que le motif RVxF est le motif d’interaction principal entre PfI2 et PP1, contrairement au motif HYNE, qui jouerait plus un rôle de stabilisateur dans la formation du complexe PfI2/PP1 (Fréville et al. 2013).

Cadre

et

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La protéine phosphatase de type 1 (PP1) est l’enzyme responsable de 90% des déphosphorylations ayant lieu dans la cellule. La PP1 joue un rôle dans divers processus cellulaires tels que le métabolisme du glycogène, la transcription et le cycle cellulaire. Cette protéine est toujours associée à un régulateur (plus de 200 répertoriés), ce qui lui confère une localisation, une spécificité de substrat et une régulation de son activité.

Chez P. falciparum, la caractérisation de PfPP1 a permis de démontrer son rôle crucial dans la biologie du parasite. Les études récentes du phosphatome de Plasmodium, utilisant la génétique inverse, ont également confirmé son essentialité à la survie du parasite. En effet, l’interruption du gène codant pour PP1 (par des expériences de Knock-Out) a mis en évidence qu’aucune autre protéine phosphatase ne pouvait remplacer les fonctions de cette dernière. Malgré l’importance de PP1, son mode de fonctionnement et sa régulation sont encore mal définis aujourd’hui. Etant donné que cette phosphatase est toujours associée à un partenaire, les recherches du laboratoire se focalisent sur l’étude des régulateurs de PP1 chez P. falciparum.

Dans ce contexte, des analyses comparatives sur le génome de P. falciparum ont permis d’identifier 4 régulateurs potentiels de PfPP1 : PfLRR1, PfI3, PfI2 et PfeIF2β.

Les analyses in silico ont montré que ces protéines ont des séquences plus courtes et possèdent une homologie inférieure à 50% avec leurs homologues chez l’Homme et la levure. Différentes approches expérimentales, nous ont permis de montrer que LRR1, I3 et I2 sont exprimés par Plasmodium et interagissent avec la PfPP1. Tandis que PfLRR1 et PfI2 sont des inhibiteurs de PfPP1, PfI3, contrairement à ses homologues, en serait un activateur. Les expériences de génétique inverse suggèrent que ces régulateurs sont indispensables pour la survie du parasite. En effet, des expériences d’interruption de gène par Knock-Out n’ont pas permis d’obtenir des parasites viables. Enfin, il a été montré in vitro que l’utilisation de peptides pénétrant dérivés des motifs d’interaction RVxF de PfI3, pouvait inhiber la croissance du parasite P. falciparum.

Suite aux résultats obtenus sur l’inhibiteur 2 de P. falciparum et dans le but d’approfondir et de poursuivre l’étude sur les régulateurs de PfPP1, les deux objectifs majeurs de ma thèse sont :

Dans un premier temps, les études se sont portées sur le rôle et l’impact d’un motif additionnel de liaison de PfI2 sur l’interaction et la fonction de la phosphatase PfPP1. Notre première étude a montré que PfI2 interagit avec PfPP1 et inhibe 80% de son activité. De plus, sa localisation nucléocytoplasmique, comme celle de PfPP1, suppose une régulation de la phosphatase à plusieurs niveaux. Des études de génétique inverse ont permis de suggérer que PfI2 est essentiel au cycle de développement intra-érythrocytaire du parasite. PfI2 possède deux motifs d’interaction : KTISW, correspondant au motif dégénéré RVxF, et HYNE. Une mutation du motif KTISW ou HYNE n’affecte pas l’interaction avec la PfPP1 alors qu’elle a un impact sur la régulation de l’activité phosphatase. En effet, la mutation du motif KTISW entraîne une perte totale de la fonction régulatrice de l’inhibiteur 2, tandis qu’une mutation

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sur le motif HYNE diminue de 50% seulement sa fonction. D’après les résultats obtenus, le motif KTISW semble donc essentiel pour la fonction régulatrice de PfI2 alors que le motif HYNE aurait plus un rôle de stabilisateur pour le complexe PfI2/PfPP1. L’analyse plus fine de la séquence de PfI2 a montré l’existence d’un motif FxxR/KxR/K, dont la coprésence avec le motif RVxF a été rapportée. Son rôle dans PfI2 n’a pas encore été défini. Par conséquence, nous avons entrepris différentes approches expérimentales afin d’évaluer la contribution du motif d’interaction FKEKRK (FxxR/KxR/K) de PfI2, dans la relation structure/fonction du complexe PfI2/PfPP1. Dans ce but, plusieurs axes ont été développés:

 L’importance du motif FxxR/KxR/K dans l’interaction avec PfPP1.

 L’impact de ce motif sur la fonction de PfI2 vis-à-vis de la régulation de l’activité de PP1.

 L’étude in vivo du rôle du motif FKEKRK de I2 chez P. falciparum.

La seconde partie de ma thèse a consisté en la caractérisation moléculaire et fonctionnelle du facteur de traduction PfeIF2β. Celui-ci est décrit comme étant l’un des nombreux facteurs intervenant durant la traduction. eIF2β, avec les sous-unités eIF2α et eIF2γ, forment le complexe eIF2, impliqué dans l’initiation de la traduction et essentiel à la synthèse protéique. En effet, eIF2 se fixe au GTP et à l’ARNt initiateur méthionine, permettant à ce dernier de se fixer à la petite sous-unité du ribosome, entraînant ainsi le processus de traduction. Le deuxième rôle d’eIF2β, décrit récemment, serait d’interagir avec PP1 et d’inhiber son activité. Chez P. falciparum, eIF2β a été identifié et montre des différences significatives avec son homologue humain, ce qui nous a amenés à l’étudier d’un point de vue biochimique et biologique, ainsi que la relation structure-fonction avec PfPP1. Pour répondre à ce sujet, plusieurs stratégies ont été mises en place :

 L’analyse bioinformatique de la séquence de PfeIF2β.

 La caractérisation de l’interaction potentielle entre PfeIF2β-PfPP1 et les motifs impliqués dans celle-ci.

 L’étude de la fonction de PfeIF2β sur l’activité de PP1 et de l’importance des motifs sur cette régulation.

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