1. Annotation de la séquence de PfeIF2β
Des analyses de bioinformatique comparative ont permis l’identification, dans le protéome de P. falciparum, de différents partenaires de la protéine phosphatase 1 (PP1). En réalisant un alignement de la séquence d’eIF2β humain dans la banque de données de PlasmoDB, le facteur d’initiation de type 2 sous-unité β a été identifié, au niveau du chromosome 10, chez le parasite : PfeIF2β (PF3D7_1010600).
La séquence codante de PfeIF2β a été amplifiée par PCR à partir de l’ADNc de P. falciparum dans le but de confirmer les informations présentes dans la banque de données. Après analyse, la séquence est composée de 669 nucléotides soit 222 acides aminés (Figure 13) confirmant ainsi les prédictions de la base de données PlasmoDB. De plus, grâce à plusieurs PCR, la présence d’un seul cadre de lecture et d’un unique codon stop a été vérifiée.
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Après avoir réalisé l’alignement des séquences protéiques d’eIF2β de P. falciparum et de l’Homme, plusieurs différences ont été observées. La séquence de PfeIF2β est composée de 222 acides aminés, elle est 30% plus courte que son homologue humain avec 335 acides aminés. Cependant, une identité de séquence de l’ordre de 47% est observée au niveau de la partie C-terminale. Dans cette partie, le domaine de la superfamille eIF2/eIF5 est présent (Figure 14, souligné en vert). Trois blocs lysines, qui jouent un rôle dans la liaison à l’ARN, sont identifiés sur la séquence d’eIF2β de l’Homme alors qu’un seul est présent chez P. falciparum (Figure 14, souligné en orange). Les motifs potentiels d’interaction à PP1, RVxF et FxxR/KxR/K sont conservés chez le parasite mais une différence existe (Figure 14, encadrement rouge et vert respectivement). Le motif KVAW, correspondant au motif dégénéré RVxF, se situe dans la partie C-terminale alors qu’il se trouve dans la partie N- terminale chez son homologue humain. Le motif C2-C2, situé dans la partie C-terminale, correspondant au motif doigt de zinc, est conservé chez les deux espèces (Figure 14, encadrement bleu). Il serait impliqué dans l’étape de reconnaissance du codon AUG (méthionine) de la traduction. Chez l’Homme, il existe deux sites de fixation à la GTP (DEEG et NKKD) contre un seul pour le parasite (DGIG) (souligné en bleu, Figure 14). De plus, une autre différence est observable chez le parasite, 3 sites de phosphorylation sont identifiés alors que quatre sont présents chez l’homme (la thréonine 90 et les sérines 23 et 205 chez le parasite, et les sérines 2, 13, 67 et 218 chez l’homme Figure 14, écrit en rouge).
Figure 14 : Alignement des séquences protéiques d’eIF2β de P. falciparum et de l'Homme. Les traits colorés
en orange, bleu et vert représentent respectivement les blocs lysines, les motifs de fixation au GTP et le domaine de la superfamille eIF2/eIF5. Les carrés vert, rouge et bleu désignent le motif de fixation FxxR/KxR/K,
le motif d’interaction RVxF et le motif C2-C2 (doigt de zinc) respectivement. Les acides aminés écrits en rouge montrent les sites de phosphorylation identifiés/caractérisés.
2. Etude phylogénétique
Au vu des différences présentes sur la séquence protéique, un arbre phylogénétique d’eIF2β a été réalisé en se basant sur 67 espèces différentes. En prenant en compte tous les taxons, eIF2β semble former un groupe mono-phylogénétique sauf pour les mammifères, les poissons et les amphibiens (Figure 15A). Cependant, les caractéristiques moléculaires, incluant les domaines conservés tels que les motifs d’interaction ou de fixation au GTP, montrent que les différents facteurs des vertébrés sont semblables (Figure 15B). Il est aussi intéressant de noter que les champignons, les insectes, les poissons, les amphibiens et les mammifères ont une extension au niveau N-terminal d’eIF2β. De plus, le motif FxxR/KxR/K et un domaine de fixation au GTP supplémentaire ont été identifiés au niveau de cette partie
PfeIF2β ---MEDK---VEDAGSAF 12
HseIF2β MSGDEMIFDPTMSKKKKKKKKPFMLDEEGDTQTEETQPSETKEVEPEPTEDKDLEADEEDTRKKDASDDL 70
PfeIF2β VDL----DKIVNDDSKQLFDFGE---KKKKKK---KKEVV 42
HseIF2β DDLNFFNQKKKKKKTKKIFDIDEAEEGVKDLKIESDVQEPTEPEDDLDIMLGNKKKKKKNVKFPDEDEIL 140
PfeIF2β EKVEEIIIDG---TGKVFERG-AVYPYDELLHRIQDLINKHNIDLCIS--KKYTIKPPQVV 97
HseIF2β EKDEALEDEDNKKDDGISFSNQTGPAWAGSERDYTYDELLNRVFNIMREKNPDMVAGEKRKFVMKPPQVV 210
PfeIF2β RVGSKKVAWINFKDICTIMNRNEEHVFHFVLAELGTEGSIAGEGQLVLKGKYGPKHIEALLRKYITEYVT 167
HseIF2β RVGTKKTSFVNFTDICKLLHRQPKHLLAFLLAELGTSGSIDGNNQLVIKGRFQQKQIENVLRRYIKEYVT 280
PfeIF2β CQMCKSPNTTMEKDSRTRLFHQHCNACGAKRSVTTIKSGFHAL-GRGERRKAKHTN 222
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sauf pour les champignons. Ces différences suggèrent un gain de fonction pour ces organismes au cours de l’évolution(Figure 15B).
Figure 15 : Etude phylogénétique de la séquence protéique du facteur eIF2β. A : Représentation de l’arbre
phylogénétique d’eIF2β, basé sur la séquence d’acides aminés de 67 espèces différentes, avec un maximum de probabilité. Les points bleus et rouge représentent les branches internes avec une valeur supérieure à 50 et 80% respectivement. La protéine eIF2β de P. falciparum est identifiée par une flèche. Les numéros d’accession
sont regroupés dans le tableau 10 de la section Matériel et Méthodes. B : Représentation simplifiée de la séquence protéique d’eIF2β pour chaque groupe présent dans l’arbre.
3. Etude des structures secondaire et tertiaire
D’après différentes analyses structurales, PfeIF2β, protéine de 25.3kDa, est très structurée et composée de 6 hélices α et 8 feuillets β (9 hélices α et 7 feuillets β chez l’Homme). De plus, il est important de souligner que les motifs KVAW et FGEKKK se situent
A
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dans un feuillet β et une hélice α respectivement (Figure 16), ce qui n’est pas habituel puisqu’en général, le motif d’interaction RVxF se situe dans une partie non structurée de la protéine.
Figure 16 : Schématisation de la structure secondaire d’eIF2β de l’Homme et de P. falciparum. Les cylindres
roses et les flèches jaunes correspondent respectivement aux hélices α et feuillets β (réalisé à partir des données issus du site Psipred). Les flèches verte et rouge représentent respectivement le motif FxxR/KxR/K et
le motif RVxF.
Afin d’étudier la structure tertiaire de la protéine eIF2β de P. falciparum, une prédiction du modèle a été réalisée en se basant sur le facteur aIF2β de Pyrococcus furiosus (Figure 17A). L’obtention du modèle prédit de PfeIF2β (Figure 17B) montre une conservation spatiale du domaine « helix-turn-helix » (HTH, représenté en vert foncé, Figure 17), qui fait partie des domaines de liaison à l’ADN. Le domaine HTH semble jouer un rôle dans l’interaction avec eIF2γ (Sokabe et al. 2006). De plus, la superposition des modèles met en évidence une conservation de la partie centrale de la protéine IF2β entre les deux espèces (Figure 17C).
1 222 PfeIF2β
HseIF2β
333 1
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Figure 17 : Modélisation de la structure tertiaire de PfeIF2β. Structure tertiaire d’eIF2β de Pyrococcus furiosus
(A) et de P. falciparum (modèle prédit, B), représentée à 180°.) (RMSD = 2.3Å). Les parties N-terminale et C- terminale sont colorées respectivement en bleu et rouge. Le domaine helix-turn-helix (HTH) et le domaine de fixation au zinc sont représentés en vert et orange respectivement. L’ion zinc est désigné par une sphère grise.
Superposition des deux modèles (C)