1. Réalisation des constructions
Pour obtenir la séquence codante de PfeIF2β, des PCR ont été réalisées, avec les couples d’amorces p1-p3 et p2-p3 (décrits dans le Tableau 9), sur l’ADNc d’une culture asynchrone de parasites P. falciparum 3D7, avec la polymérase Advantage2 (Clontech). Les produits de PCR ont été sous-clonés dans le vecteur pCR2.1-TOPO et séquencés. Après analyse et vérification des séquences, la région codante de PfeIF2β a été sous-clonée dans les plasmides pETDuet-1 et pGEX4T3 pour avoir une protéine fusionnée à l’étiquette 6histidine ou GST respectivement. Les bactéries compétentes E. coli BL21 (Invitrogen) ont été transformées avec les ADN plasmidiques afin d’induire l’expression des protéines.
Pour obtenir les différentes constructions des mutants de PfeIF2β, des mutagénèses dirigées par PCR ont été réalisées, employant le kit ISIS Proofreading DNA Polymerase (Qbiogene). PfeIF2β sauvage en pETDuet-1 a été utilisé comme matrice, avec les couples d’amorces p4-p5 et p6-p7 (Tableau 9) pour obtenir respectivement la construction mutée sur le site FxxR/KxR/K nommée PfeIF2β-29AGEAKA34 et sur le site RVxF nommée PfeIF2β- 103KAAA106. Pour obtenir la protéine mutée sur les deux motifs d’interaction, une mutagénèse dirigée par PCR a été réalisée sur la séquence de PfeIF2β-29AGEAKA34 avec les amorces p6-p7. Les différentes PCR ont été réalisées selon le protocole fourni. L’ADN plasmidique, ayant servi de matrice, a été digéré par l’enzyme DpnI, puis les transformations dans les bactéries compétentes BL21 ont été réalisées. Après vérification par séquençage, les protéines recombinantes sont produites.
Pour obtenir, la construction PfeIF2β en pGADT7, une PCR a été réalisée sur l’ADNc, issu d’une culture de parasites asynchrone de P. falciparum, avec le couple d’amorces p14- p15 (Tableau 9) grâce au kit Advantage2 PCR. Les produits de PCR ont été clonés dans le vecteur pCR2.1-TOPO et séquencés. Après analyse et vérification des séquences, la région codante de PfeIF2β a été sous-clonée dans le plasmide pGADT7, qui permettra la synthèse de l’ARNm de PfeIF2β.
Pour avoir la séquence codante de PfeIF2α, PfeIF2γ et PfeIF5, des PCR ont été effectuées, avec les couples d’amorces p10-p11, p12-p13 et p8-p9 respectivement (décrits dans le Tableau 9), sur l’ADNc d’une culture asynchrone de parasites P. falciparum 3D7, avec la polymérase Advantage2 (Clontech). Le produit de PCR est ligué au plasmide pETDuet-1, au niveau des sites de restriction BamHI/SalI, grâce au kit In-Fusion® HD Cloning (Clontech). Les bactéries compétentes Stellar sont transformées avec le plasmide contenant le produit de
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PCR. Après analyse et vérification des séquences, les bactéries BL21 seront transformées avec l’ADN et les protéines recombinantes sont ensuite produites.
2. Production des protéines recombinantes tagguées 6Histidines
a. Protéine PfelF2β
Les bactéries compétentes E. coli BL21 ont été transformées pour permettre la production des différentes protéines de PfeIF2β (sauvage et mutées). La production de la protéine PfeIF2β a été induite par l’ajout de 500µM d’IPTG (Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside, Euromedex) dans du milieu LBA et en présence de 50µM de ZnCl2 pendant 3h à 30°C. Les bactéries sont lysées dans un tampon de lyse (20mM Tris-HCl pH 7.4, 500mM NaCl, 50µM ZnCl2 (Sigma), 40mM Imidazole, 1% Triton-X100, DNAse et un cocktail inhibiteur de protéases (Roche)) pendant 1h à 4°C sur roue. Après sonication (BRANSON Digital Sonifier) et centrifugation (10 000tr/min, 30min à 4°C), l’extrait protéique obtenu est filtré et mis en contact avec les billes Ni-NTA agarose (préalablement équilibrées avec le tampon de lyse) (Macherey-Nagel), 1h à 4°C. Après 10 lavages avec un tampon 20mM Tris- HCl pH 7.4, 500mM NaCl, 50µM ZnCl2, 40mM Imidazole, les protéines sont éluées dans du tampon d’élution (20mM Tris-HCl pH 7.4, 500mM NaCl, 50µM ZnCl2, 600mM Imidazole) pendant 1h à 4°C. Celles-ci sont ensuite dialysées une nuit à 4°C contre le tampon 20mM Tris-HCl pH 7.4, 500mM NaCl, 50µM ZnCl2. La pureté de la protéine est vérifiée par SDS- PAGE 15% coloré par la solution SimplyBlueTM Safe Staining (Invitrogen). La protéine recombinante PfeIF2β sauvage tagguée 6his a été analysée par spectrométrie de masse MALDI-TOF pour confirmer son identité. Les protéines sont ensuite dosées en utilisant le kit BCA assay et/ou le nanovueplus (GE Healthcare).
Les protéines PfeIF2α, PfeIF5 sont produites dans les mêmes conditions que la production de la protéine PfeIF2β. La production de la protéine PfeIF2γ est aussi effectuée dans les mêmes conditions sauf qu’il faut ajouter 25mM de MgCl2 dans chaque tampon.
b. Protéines PfPP1
La protéine recombinante PfPP1-6his est obtenue après une induction( avec 500mM d’IPTG) faite sur la nuit à 16°C en présence de 1mM MnCl2 dans du milieu LBA. Le culot est repris dans du tampon de lyse (20mM Tris, 150mM NaCl, 20mM Imidazole, 1mM MnCl2, 1% Triton-X100, 1mg/mL lysozyme (Sigma), un cocktail inhibiteur de protéases, et de la DNase). Après une incubation d’1h sur roue à 4°C, une sonication et une centrifugation de 30min à 10000tr/min à 4°C sont réalisées. Le surnageant filtré (filtre 0,45µm) est déposé sur la colonne de Nickel (Protino® Ni-NTA Columns 1mL, Macherey-Nagel) de la chromatographie (Biologic LP de Biorad). La protéine PfPP1 est ensuite éluée dans un tampon d’élution (20mM Tris, 150mM NaCl, 600mM Imidazole, 1mM MnCl2) et dialysée toute une nuit à 4°C, contre un tampon Tris 20mM, NaCl 150mM et MnCl2 1mM. La protéine est déposée sur gel d’acrylamide 15%, puis colorée avec la solution SimplyBlueTM Safe Staining, parallèlement la protéine est dosée à l’aide d’un spectrophotomètre (Nanovue).
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3. Production des protéines recombinantes tagguées GST
L’expression de la protéine recombinante PfeIF2β-GST sauvage est réalisée, selon le protocole précédemment décrit avec quelques modifications, notamment au niveau des différents tampons utilisés qui ne contiennent pas d’imidazole. L’extrait protéique est mis en contact avec des billes Glutathione-Sepharose (Sigma) (préalablement réhydratées 1h dans du tampon 20mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 0,1% Triton-X100) une nuit à 4°C. Après 5 lavages avec le tampon 20mM Tris-HCl pH 7.4, 500mM NaCl, 50µM ZnCl2, 0,1% Triton-X100, les billes sont conservées dans un tampon 20mM Tris-HCl pH7.4, 500mM NaCl, 50µM ZnCl2 à 4°C (1v/1v).
L’expression des protéines PfPP1-GST ou GST utilise le même protocole sauf que les tampons contiennent 150mM de NaCl, il n’y a pas de ZnCl2 et pour la protéine PfPP1, 1mM de MnCl2 doit être ajouté pour garder son activité.