Perturbation du niveau de surenroulement

On abordera ici les facteurs physico-chimiques et les processus dont les altérations de la structure double brin de l’ADN qu’ils provoquent, sont susceptibles d’être compensées par une modification du surenroulement. La variation du nombre d’enlacements topologiques d’un substrat ADN ΔLk est souvent détectée par électrophorèse sur gel d’agarose en présence d’un liguant dénaturant qui s’intercale, tels le bromure d’éthidium et la chloroquine. Les molécules d’ADN surenroulées, qui diffèrent par valeur unitaire de Lk, sont alors « résolues » (Bauer and Vinograd, 1971). Des plasmides extraits de cellules ayant poussé dans différentes conditions, peuvent alors être analysés, permettant d’évaluer l’effet

in vivo des différents facteurs sur la densité de surenroulement (figure 28).

a) Les facteurs environnementaux

Les facteurs environnementaux tels la température, la force ionique, le pH, etc. ont généralement pour effet d’altérer les liaisons hydrogène internes mais également les liaisons

Figure 29 : la température augmente la densité de surenroulement total chez E. coli. A :

électrophorèse sur gel d’agarose/chloroquine du plasmide pBR322 isolé chez E. coli en phase exponentielle de croissance en milieu riche à 17°C (a) et à 37°C (b). B : tracés densitométriques du profil de bandes de la figure A (d’après Goldstein et Drlica, 1984). Sens de la migration Formes relâchées A B Température de croissance (°C) Densité de surenroulement

Figure 30 : la température diminue la densité de surenroulement total chez l’archaea thermophile

Haloferax volcanii. Représentation graphique de la

densité de surenroulement du plasmide pHV11 en fonction de la température de croissance en phase exponentielle de croissance en milieu riche chez H.

volcanii (d’après Mojica et al, 1994).

systématiquement par une augmentation du nombre de liens topologiques à toutes les phases de croissance (Shure et al., 1977; Stupina and Wang, 2005). Cette augmentation ne reflèterait pas seulement une augmentation du nombre de supertours négatifs per se (ΔWr < 0) mais un mécanisme par lequel les paramètres de l’hélice seraient maintenus constants (Goldstein and Drlica, 1984) (figure 29). En effet, il a été calculé que la diminution de la température augmente le nombre de tours d’hélices de 0,012°/pb/°C (Depew and Wang, 1975). Chez l’archaea halophile et thermophile Haloferax volcanii, l’effet inverse est observé: la densité de surenroulement augmente avec la température (Mojica et al., 1994)(figure 30). En effet, plasmide pGT5, isolé de l’archaea hyperthermophile Pyrococcus abyssi qui vit entre 68 et 101,5 °C dans les sources hydrothermales, présente une densité de surenroulement de - 0,026 à 25 °C. La densité de surenroulement calculée à 95°C serait de - 0,06, c’est à dire proche d’un état relâché (Charbonnier et al., 1992). ii) L’osmolarité L’augmentation de la force ionique sur une structure d’ADN-B a pour effet la transition vers une structure d’ADN-A dont le diamètre et le nombre de paire de bases par tour d’hélice sont plus importants (Franklin and Gosling, 1953). En effet, le diamètre effectif de la double hélice d’ADN diminue de 15 à 3 nm quand la concentration en NaCl augmente de 0,01 M à 1 M, en raison des cations qui neutralisent les charges négatives de l’ADN (Vologodskii and Cozzarelli, 1994). A des concentrations physiologiques en ions Na+ _{(entre 0,05 M et 0,3 M),}

cela aboutit à une diminution de la densité de surenroulement négative jusqu’à des valeurs proches du relâchement (Brady et al., 1987). Il en est de même pour les ions Mg2+_{, mais}

seulement à des concentrations inférieures à 0,5 mM et en présence d’ions Na+ en conditions physiologiques. L’effet de ce dernier est alors inversé par rapport à celui observé

Figure 32 : le NaCl augmente la densité de surenroulement total chez l’archaea halophile Haloferax

volcanii. Représentation graphique de la densité de

surenroulement du plasmide pHV11 en fonction de la concentration en NaCl en milieu riche de croissance en phase exponentielle chez H. volcanii (d’après Mojica et al,

1994).

Densité de surenroulement

Figure 31 : le NaCl augmente la densité de surenroulement total in vivo. A : électrophorèse sur gel d’agarose/chloroquine du pACYC184 isolés de S. thyphimurium en phase exponentielle de croissance en milieu riche additionné de 0,3 M de NaCl (b) ou non (a). B : électrophorèse sur gel d’agarose/chloroquine du pACYC184 isolé chez E.

Coli en phase exponentielle de croissance en

milieu riche (a, b) ou en milieu minimum (c, d) additionné de 0,3 M NaCl (b, d) ou non (a, c) (d’après Higgins et al, 1988). A B Formes relâchées A (a) (b) B (a) (b)

Figure 33 : la croissance anaérobie augmente la densité de surenroulement total in vivo. A : électrophorèse sur gel d’agarose/chloroquine du pACYC184 isolé chez E. coli cultivée sur la nuit en milieu minimum (MMA) aérobie (a) ou anaérobie (b) (d’après Dorman et al, 1988). B : électrophorèse sur gel d’agarose/chloroquine du pACYC184 isolé chez S. thyphimurium cultivée sur la nuit en milieu riche anaérobie (a) ou aérobie (b) (d’après Yamamoto et Droffner, 1985). Formes relâchées Formes surenroulées

(Rybenkov et al., 1997), dépend directement de sa concentration extracellulaire (Lusk et al., 1968). On s’attend donc à ce que la force ionique extracellulaire influence la densité du surenroulement de l’ADN. In vivo, l’augmentation de l’osmolarité extracellulaire conduit à une augmentation de la densité de surenroulement, indépendamment du plasmide étudié, chez E. coli ou chez Salmonella thyphimurium en phase exponentielle de croissance en milieu riche (Higgins et al., 1988; Hsieh et al., 1991) (figure 31) ainsi qu’en phase stationnaire (Conter, 2003). L’augmentation de la concentration en NaCl de 0 à 0,5 M (3 %) en milieu riche de culture produit une augmentation de 10 % de la densité de surenroulement. Les plasmides extraits de cellules en croissance dans un milieu riche sans NaCl, montrent une diminution de la densité de surenroulement par rapport aux plasmides extraits de cellules cultivées en présence de NaCl (à partir de 300 mM soit 1,8 %). Le niveau de surenroulement peut être restauré par l’ajout de NaCl (à partir de 100 mM soit 0,6 %). Les concentrations intracellulaires de cations seraient susceptibles de varier de l’ordre de 6 à 10 fois pour contre-balancer l’effet de la température sur le pas de l’hélice ADN (Anderson and Bauer, 1978). Aussi, comme observé pour la température, l’effet contraire est observé chez l’archaea Haloferax volcanii dont la croissance est optimale dans un milieu contenant 15 % de NaCl et 10 % de MgCl2. L’augmentation de la concentration en MgCl2 du milieu de

1,5 à 30 % montre une diminution de la densité de surenroulement de 7 %. En revanche, la diminution ou l’augmentation de la concentration en NaCl extracellulaire entre 5 et 25 % mène nécessairement à une augmentation du surenroulement de 4 %, indiquant que l’ADN est sous forme relâchée à concentration optimale de croissance (Mojica et al., 1994) (figure 32). iii) L’anaérobiose

responsables de l’altération de la structure tertiaire de l’ADN menant au relâchement topologique. Il s’agit d’une rupture de la liaison phosphodiester qui peut être directement causée par des espèces chimiques oxygénées (réductrices) produites par le métabolisme de l’oxygène ou par radiolyse de l’eau lors d’irradiations. Il peut aussi s’agir d’un effet indirect comme une rupture de la liaison N-osidique (entre la base et le désoxyribose) lors d’une augmentation de la température. L’angle de rotation de deux bases consécutives est diminué de 12°, entrainant une dénaturation donc une diminution du nombre de supertours négatifs; la liaison phosphodiester étant alors fortement déstabilisée, elle se rompt à son tour. La modification de l’angle de rotation peut également être provoquée par des modifications de base telles l’alkylation ou la méthylation, ou encore par la création de dimères de pyrimidine lors d’irradiations aux UV. Par exemple, la formation de dimères de résidus thymines, adjacents sur le même brin, créé un noyau cyclobutane dont les liaisons C- C du dimère sont plus courtes que la distance d’empilement de 0,34 nm séparant deux bases successives de l’ADN-B. L’angle de rotation des bases est diminué de 14,3°. La méthylation d’une purine par un agent chimique (le méthanesulfonate de méthyle) diminue la rotation de 3,4°, tandis que celle réalisée par une enzyme n’altère pas le surenroulement (Spadari et al., 1987).

b) Les processus cellulaires

La densité de surenroulement est également dépendante de la fixation de l’ADN par des facteurs qui modifient la structure de la double hélice ou contraignent des supertours. Il s’agit de complexes impliqués dans les réactions enzymatiques dépendantes de l’ADN comme la réplication et la transcription, mais également la fixation de NAPs (Travers and Muskhelishvili, 2005).

entrainant une modification de l’angle de rotation inter-bases. Cette dépurination ou dépyrimidination, est ensuite reconnue par les endonucléases AP qui cassent la liaison phosphodiester. Dans le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) endommagés par irradiations aux UV, les enzymes UvrA, UvrB et UvrC sont en charge de rompre directement le squelette sucre-phosphate (Kisker et al., 2013).

ii) La fixation de protéines

Les protéines se fixant à des séquences d’ADN spécifiques introduisent des changements structuraux locaux tels la courbure, la torsion, ou l’enroulement, pouvant affecter le niveau de surenroulement. En effet, les variations du nombre d’enroulement et de densité de supertours peuvent être déduites de la surface géométrique d’interaction entre une protéine et son substrat (White et al., 1988). La variation du nombre de liens topologiques (ΔLk) générée par la fixation de protéines, telles λO, GalR, et CRP qui enroulent l’ADN et LacI et AraC qui forment des boucles, ont ainsi été calculées in vitro sur plasmide (Chen et al., 2010). Cette variation est une propriété spécifique de la protéine qui n’est pas corrélée avec la constante de fixation ou la courbure induite : ces dernières induisent toutes un déficit de liens topologiques, excepté CRP. Dans ce cas, on parle du paradoxe du nombre de liens topologiques: l’absence de déficit serait compensée par le nombre d’enroulements (White et al., 1992). Ainsi, on peut plutôt mesurer la variation de densité de surenroulement. La protéine Lrp contraint des supertours positifs chez Bacillus subtilis tandis que chez E. coli, elle semble contraindre des supertours négatifs (Tapias et al., 2000). La fixation de IHF à l’ADN induit un tour d’hélice moyen d’ADN de 34°/pb, introduisant un léger surenroulement négatif (Swinger et al., 2003). En absence de HU, la densité de surenroulement diminue d’environ 12% chez E. coli (Hsieh et al., 1991) et S. thyphimurium

DnaB

Figure 34 : représentation schématique du modèle d’ouverture de la double hélice pour l’initiation de la réplication. L’oligomérisation de DnaA sur l’ADN simple brin permet l’ouverture de la double hélice au niveau de la région instable DUE riche en AT. L’hélicase agrandit alors l’orisome en recrutant la primase DnaG pour former le primosome avant la formation du replisome (d’après Stratmann et van Oijen, 2014). DnaA OriC Boîtes DnaA DUE Primosome DnaC DnaG Orisome _DnaB

Figure 35 : représentation schématique du modèle topologique de la région d’ADN en cours de réplication. L’initiation crée des supertours à l’avant de la fourche (a), qui diffusent à l’arrière de la fourche sous forme de pré-caténanes, diminuant le surenroulement positif à l’avant de la fourche (b). Le maintien du surenroulement positif serait nécessaire pour garder la double hélice ouverte (c) (d’après Postow et al, 2001). (c) Domaine répliqué Domaine en réplication Domaine pré-répliqué Pré-caténanes Supertours (a) Réplication

(Chintakayala et al., 2013). L’oligomérisation de H-NS introduit des supertours positifs (Arold et al., 2010) comme la condensation de l’ADN par MukB in vivo (Sawitzke and Austin, 2000). iii) L’avancée du replisome Les chromosomes bactériens disposent généralement d’une seule origine de réplication oriC de 245 pb. On y trouve deux types de séquences de 13 pb, répétées trois fois, appelées DUE (DNA Unwinding Element) et qui sont riches en AT: la dissociation des deux brins y est donc favorisée (Bramhill and Kornberg, 1988). Stimulée par DiaA, l’oligomérisation ATP- dépendante de DnaA étire la double hélice d’ADN de 0,42 nm à 0,65 nm (Duderstadt et al., 2011) ce qui ouvre la double hélice sur 28 ou 44 à 46 pb en absence ou en présence d’un filament de monomères SSB (Single Strand Binding Protein) qui se fixent et protègent l’ADN simple brin (Krause and Messer, 1999). Cet orisome permet le recrutement de la chaperonne homohexamèrique DnaC-ATP liée à l’hélicase ATPase homohexamérique DnaB dont elle bloque l’activité (Davey et al., 2002). L’hydrolyse de l’ATP permet à DnaB, qui forme un anneau autour de chaque brin, d’agrandir la bulle de réplication à 65 nt (Fang et al., 1999) et d’interagir avec la primase DnaG qui synthétise les amorces ARN pour l’initiation de la synthèse d’ADN (Bailey et al., 2007) (figure 34). SSB régule également l’activité de l’hélicase (Baker et al., 1987). Les deux anneaux se déplacent de 5’ en 3’ en rompant les liaison hydrogène liant les deux brins d’ADN. Ce déroulement local de l’ADN par les hélicases réduit le nombre de tours d’hélice : des supertours positifs compensatoires doivent donc être générés à l’avant de la fourche de réplication et s’accumuler avec l’avancée du replisome (Cozzarelli and Wang, 1990). Ce surenroulement positif a en réalité été détecté par microscopie électronique sur l’ensemble de la région d’ADN partiellement répliquée in vitro et in vivo (Peter et al., 1998): le stress de surenroulement positif diffuse

Figure 36 : enroulement de l’ADN autour de l’ARN polymérase d’E. coli

A : image de microscopie à force atomique de complexes ARN polymérase-ADN d’E. coli. Les valeurs en nanomètres correspondent aux mesures de longueur du contour des différentes molécules d’ADN, permettant d’estimer l’enroulement de la molécule d’ADN autour de l’ARN polymérase. B : représentation tridimensionnelle de l’enroulement de l’ADN autour de l’ARN polymérase selon Polyakov et al, 1995 (d’après Rivetti et al, 1999). Transcription B A Figure 37 : représentation schématique de la dénaturation de l’ADN par l’ARN polymérase. La fixation de l’holoenzyme et notamment du facteur σ au promoteur forme le complexe fermé (RPc), est suivie d’une courbure à 100° de la région ADN en amont de l’initiation autour de l’ARN polymérase. L’entrée du site d’initiation dans le tunnel menant au site actif de l’ARN polymérase, courbe l’ADN une deuxième fois à 90°, ouvrant la double hélice d’ADN pour former le complexe ouvert de transcription (RPO) (d’après Ruff et al, 2015). RPC RPO Figure 38 : représentation schématique du twin domain de la transcription. Le surenroulement induit en avant de la bulle de transcription est positif, tandis que le surenroulement induit en aval est négatif (d’après ARN polymérase Supertours négatifs Transcription Supertours positifs

stimule la transcription, le facteur σ (Burgess et al., 1969). L’événement de nucléation nécessite en effet la fixation de la sous-unité σ à l’ARN polymérase, diminuant son affinité pour les promoteurs (Murakami et al., 2002). Des mutations dans les gènes rpoB et rpoC, codant les sous-unités catalytiques β et β’ de l’ARN polymérase respectivement, mènent de façon respective à une diminution et à une augmentation de la sensibilité de la cellule à la coumermycine, un inhibiteur spécifique de l’ADN gyrase (Mirkin et al., 1979). L’activité d’élongation de la transcription a donc un effet sur le surenroulement de l’ADN. La résolution de la structure du cristal de l’enzyme cœur ARN polymérase de la bactérie

Thermus aquaticus a permis de mieux comprendre cet effet (Zhang et al., 1999): une

courbure à 90° de l’ADN est en effet observée à l’entrée du site actif. L’initiation de la transcription nécessitant une étape de nucléation entre les positions -10 et +3 du TSS (Transcription Starting Site), la région d’ADN en amont du site de nucléation présente une courbure et un enroulement gauche d’environ un tour autour de l’ARN polymérase (Rivetti et al., 1999) (figure 36). L’ADN, piégé par la fermeture de la pince formée par les deux sous- unités catalytiques β et β’, se plierait à 90° à l’entrée du site actif, se dénaturant d’environ 1 tour, sur 13 pb (Chakraborty et al., 2012; Ruff et al., 2015). En tout, deux supertours positifs seraient ainsi contraints par l’ARN polymérase (Amouyal and Buc, 1987) (figure 37). L’ajout du ribonucléotide permettrait d’autre part de maintenir la double hélice dénaturée à partir de la position suivante et permettrait la translocation du complexe suivant le modèle du moteur brownien (Vassylyev et al., 2007). Cette rotation de l’ADN durant la transcription par l’ARN polymérase d’E. coli a d’ailleurs été rapportée in vitro (Harada et al., 2001). La conséquence de cette rotation est modélisée par le twin domain proposé par Liu et Wang en 1987. Les supertours positifs générés sont énergétiquement défavorables pour l’avancée de l’ARN polymérase. Ils seraient compensés par des supertours négatifs à l’arrière de la

pouvant se former à l’arrière de la bulle de transcription in vitro et in vivo (Drolet et al., 1994). Ces structures seraient supprimées in vitro en présence de la Rnase H ou de la protéine HU. Dans le second mécanisme, l’activité de surenroulement négatif est proportionnelle à la longueur du transcrit et devient prédominante en présence de protéines courbant l’ADN, pour des transcrits dont la taille est supérieure à 3kb.

v) Transitions de croissance

Les variations de surenroulement global les plus importants ont lieu lors des transitions de phase de croissance ou de ressources nutritives : on observe une forte augmentation du surenroulement négatif suivie d’une compensation aboutissant à un niveau plus faible de surenroulement (Balke and Gralla, 1987). Il a été observé une corrélation entre le niveau global de surenroulement négatif et la charge d’énergie cellulaire (Hsieh et al., 1991). En effet, dans des cellules de E. coli en phase stationnaire, où le ratio [ATP/ADP] est faible, la densité de surenroulement d’un plasmide rapporteur est σ ≈ −0.03, c’est à dire faible (Reyes-Domínguez et al., 2003). Lorsque les cellules reprennent leur croissance et entrent en phase exponentielle, le ratio [ATP/ADP] augmente et la densité globale de surenroulement progresse au niveau moyen physiologique de σ ≈ −0.05, une valeur typique de croissance équilibrée (Kusano et al., 1996). Ces transitions pourraient être associées à l’arrêt des processus cellulaires comme la division ou la transcription.