Deux stratégies complémentaires de mesure du surenroulement diffusible

Le système idéal d’analyse du surenroulement chromosomique doit également remplir les conditions suivantes: il doit être réalisable sur des cellules en croissance et dans des conditions variées, il doit pouvoir tester de nombreuses positions sur le chromosome, et on doit pouvoir le contrôler afin d’étudier les paramètres qui peuvent l’influencer. En s’inspirant de la réaction de résolution de la résolvase de ɤδ, deux stratégies ont été élaborées afin de

Figure 1 : représentation schématique des deux principales stratégies d’étude du surenroulement diffusible dans le chromosome d’E. coli. L’efficacité de résolution en A renseigne principalement sur le surenroulement génomique inter-res, tandis que celle mesurée en B renseigne uniquement sur la dynamique de surenroulement du loci où le senseur est inséré. Dans les deux stratégies, la résolution supprime le cercle res-Lac, laissant une petite cicatrice res : les résultats peuvent donc être recensés sur milieu X-Gal par comptage des colonies bleues (non recombinantes) et blanches (recombinantes). A Cassette contenant une copie du gène marqueur lacZ insérée à un site intergénique B Paire de sites res indépendants, avec une copie du gène marqueur lacZ, insérés dans deux régions chromosomiques espacées

Figure 2 : représentation schématique de l’insertion du senseur topologique res-Lac-Gen-res de 9kb au loci intergénique kch-yciI, dans la région Ter du chromosome d’E. coli, grâce au système de recombinaison spécifique de site FLP/FRT. L’insertion de la cassette circularisée res-Lac-Gen-res-FRT à un loci d’intérêt requiert au préalable l’insertion d’un site FRT dans une souche ∆lacZ, telle la souche MG1657. Cette stratégie présentée en figure 1B, renseigne du niveau de surenroulement au loci où le senseur est intégré.

colonies qui jusqu’alors étaient bleues sur milieu X-Gal, perdent donc la capacité à hydrolyser ce substrat chromogène et deviennent blanches. Ainsi les constructions ont dû être réalisées dans la souche MG1657 (MG1655 ∆lacIZ ∆attB) (Valens et al., 2004).

a) Le senseur topologique

La première stratégie utilise un module synthétique de 9kb, appelé « senseur de supertours », qui peut être inséré à diverses positions du chromosome. Celui-ci rend compte de la dynamique de surenroulement à proximité de la cassette (Figure 1A). Cette cassette a été mise au point dans le laboratoire de Patrick Higgins (Pang et al., 2005), afin de mesurer le niveau surenroulement libre du chromosome de Salmonella enterica serovar Typhimurium. Elle contient l’opéron Lac complet, c’est à dire le gène régulateur lacI (répresseur) et les trois gènes de structure lacZ, lacY et lacA (codant la β-galactosidase, la lactose perméase et la galactoside O-acétyltransférase respectivement), ainsi qu’un gène de sélection codant pour une résistance à la Gentamycine aacC1 [aminoglycoside-(3)-N- acetyltransférase] du transposon Tn1696. Le tout est encadré par une paire de sites res en orientation directe, reconnus par la résolvase du transposon γδ. Enfin, ce module res-Lac- Gen-res est flanqué par deux sites FRT (Flp Recombination Target) en répétition directe, ciblés par la recombinase spécifique de site FLP. Cette enzyme codée par le plasmide 2µm de la levure Saccharomyces cerevisae reconnaît une séquence FRT de 65 nt comprenant une séquence cœur de 34 pb. FLP est capable de conduire in vivo chez E.coli, la recombinaison spécifique entre deux sites FRT en sens direct, menant à l’excision de la séquence contenue entre les deux sites et à l’obtention d’un seul site FRT , ou bien à l’insertion d’une séquence circulaire contenant un site FRT, à un autre site FRT (Cox, 1983). Ce système permet donc d’insérer ou d’extraire le senseur à un endroit spécifique du chromosome. L’insertion du

Figure 3 : représentation schématique de la construction de la souche MG1657resmatS6res. Les sites res sont espacés de 20,5 kb dans la région Ter du chromosome d’E. coli, correspondant à la stratégie de la figure 1A. Cette stratégie permet de rendre compte de l’effet d’une séquence génomique encadré par deux sites res, sur leur efficacité de résolution. A : le site res-lacZ est intégré par le système de recombinaison Int de λ dans la souche MG1657 R180 dont le site attR180 est placé en anti-sens dans le gène recT à environ 10 kb en aval de matS6. B : le second site res est inséré par recombinaison homologue à 20,5 kb en amont du site res-lacZ 180, et à 10 kb du site matS6 grâce au système du bactériophage λ red. Ce site res, accompagné du marqueur de sélection FRT-kan-FRT, est d’abord intégré par recombinaison homologue entre les gènes YcjY et pgrR dans la souche DY330 puis transduit dans la souche MG1657. Le site attR portant déjà le marqueur kan, la cassette kan du site res intégré est alors excisé par la recombinase FLP. Le site res-lacZ 180 obtenu en A est alors transduit dans cette souche. De cette façon, la souche MG1657resmatS6res dispose d’un site resFRT et d’un site res-lacZ 180 espacés de 20,5 kb autour de matS6.

B

génèrent une activité de recombinaison. Dans le chromosome de la souche DY330, les gènes

exo, bet et gam du phage Lambda sont placés sous le contrôle du répresseur thermosensible

cI857, puisque l’inactivation des nucléases RecBCD est létale pour la cellule ; la croissance de la souche DY330 est donc optimale à 30°C. Le module FRT-kan-FRT est ensuite transduit au locus privilégié dans la souche MG1657 et un site FRT est généré par la recombinase FLP (Cherepanov and Wackernagel, 1995; Datsenko and Wanner, 2000). La souche MG1657 contient alors un seul site FRT et le plasmide pCP20 portant la recombinase FLP thermo- inductible (sous contrôle du répresseur cI857 _{TS de λ). L’expression de la FLP est alors induite}

et la souche rendue électrocompétente est immédiatement transformée par une préparation de module res-Lac-Gen-res-FRT avec un seul site FRT. Cette préparation est obtenue de la même façon que le site FRT unique au chromosome, à partir d’une souche disposant déjà du senseur. La réaction de recombinaison par FLP entre les deux sites FRT au sein de cette souche libère un cercle comprenant le module res-Lac-Gen-res-FRT, dont l’unique site FRT peut recombiner avec le site FRT chromosomique afin de générer une souche résistante à la gentamycine avec l’opéron lac flanqué par les sites res et les sites FRT, donc Lac+. Les colonies obtenues sont donc bleues sur milieu X-Gal.

b) L’explorateur topologique

Le second essai met en jeu une paire de séquences res, insérées à deux loci, donc espacées par le génome. On étudie ainsi comment une région du chromosome, encadrée par deux sites res, module la réaction de résolution promue par la résolvase ɤδ (figure 1B). Cette expérience implique que les régions du génome ciblées soient non-essentielles.

Pour ce faire, une cassette res-lacZ a d’abord été insérée à distance d’un deuxième site res, intégré d’autre part, de sorte que la résolution, promue par la résolvase ɤδ, entraine

Figure 4 : représentation schématique de la construction des souches res de Tn3 dupliquées ΔrecA. La recombinaison intramoléculaire entre les sites attR et attL des chromatides sœurs ou de chromosomes frères promue par Int et Xis de λ, entraîne la duplication de la région inter-sites, donc des sites res, ainsi que la reconstitution du marqueur de sélection lacZ. Parmi les souches construites, seule la résolution pour les distances de duplication de 71 kb, 124 kb, 264 kb, 271 kb et 371 kb a été analysée.

L’intégration de λ repose sur la recombinaison spécifique de site, opérée par l’intégrase Int entre les sites d’attachement attB et attP, et générant deux sites hybrides attR et attL. La recombinaison inverse, entre attR et attL, nécessite l’intégrase Int et l’excisionase Xis. Une collection de souches MG1657 (MG1655 ∆lacIZ ∆attB), contenant un site attR fusionné à la partie 3’ du gène lacZ à différentes positions du chromosome, est disponible au laboratoire (Valens et al, EMBO, 2004). Ainsi, la position attR-3’lacZ-kan d’intérêt est d’abord transduite dans la souche MG1657 afin de recevoir le fragment attL-5’lacZ-amp où le site res a été cloné en amont de la partie 5’ de lacZ. Sous l’expression de Int et Xis, la reconstitution du site lacZ insère donc en même temps le site res au site cible. Le second site res est ensuite intégré par recombinaison homologue (figure 3B).

Une approche similaire consiste en l’analyse de la résolution de plus grandes régions chromosomiques prélablement dupliquées de 71kb à 391 kb. Ces souches ont été construites par Emilie Esnault au cours de son DEA au laboratoire, dans le but de préciser la distance maximale pour laquelle deux sites res de Tn3 peuvent interagir au sein d’un plectonème. Afin de s’affranchir des problèmes de létalité induits par la délétion de grandes régions du chromosome, la région inter-res a été dupliquée grâce au système de recombinaison de λ, permettant la conservation d’au moins une copie sauvage de la région testée dans chaque cellule après résolution (figure 4). Les constructions ont ainsi dû être réalisées dans un contexte ∆lacIZ ∆attB, c’est à dire dans la souche MG1657, et il a été montré que ces duplications sont stabilisées dans un contexte ΔrecA. En présence de Int et Xis de λ, les sites attR3’LacZ-res et 5’LacZattL-res intégrés en orientation directe et à une distance connue l’un de l’autre, réalisent une recombinaison intramoléculaire entre chromatides sœurs ou chromosomes frères. Cette réaction mène à la duplication de la

A

B

Figure 5 : représentation schématique du mode opératoire utilisé pour la détermination de l’efficacité de résolution de sites res intégrés au chromosome. A : vecteur d’expression de la résolvase de ɤδ sous contrôle du promoteur thermo-inductible de λ. B : méthode de mesure de l’efficacité de résolution de la résolvase de ɤδ induite à la température. L’aliquote de culture en phase stationnaire est prélevé après 16h de croissance de nuit, correspondant à une DO600 nm de 5-6 en milieu riche (LB) ou 2-3 en milieu minimum

(MMA). Une dilution au 1/100 dans le milieu approprié permet de tester la phase exponentielle de croissance dans la même journée correspondant à une DO600nm de 0,2.

des barrières (Staczek and Higgins, 1998). La réaction d’excision doit donc être limitée dans le temps : un système d’induction à la température permet de provoquer une décharge de résolvase dans la cellule. La souche à tester est transformée par le plasmide pJBɤδRes, dérivé du plasmide pACYC184 à faible nombre de copies ( 15 copies/cellule), comportant l’origine de réplication p15A, et la résolvase ɤδ sous contrôle du promoteur PL du coliphage λ

qui utilise le répresseur cI857 thermosensible (Bliska and Cozzarelli, 1987)(figure 5A). Afin d’induire l’expression de la résolvase, un aliquote de 2mL de culture est incubé dans un bain- marie à la température permissive de 42°C, en agitation pendant 10 minutes. A cette température, le répresseur ne peut plus se fixer sur les promoteurs PL, qui, actifs,

permettent la transcription de la résolvase. Six minutes sont nécessaires à l’expression de la résolvase (transcription et traduction). Une induction de 10 minutes à 42°C stimule suffisamment la synthèse de recombinase pour exciser efficacement l'ADN entre deux sites sur un plasmide (Bliska et al., 1991; Bliska and Cozzarelli, 1987; Higgins et al., 1996). L’expression de la résolvase est de nouveau réprimée par une incubation à 30°C, en agitation pendant 2 heures. Sachant que le temps moyen de génération de E. coli est de 40minutes en milieu riche (LB Lennox) et de 70 minutes en milieu minimum (MMA), cela signifie que toutes les cellules subissent au moins trois divisions cellulaires en milieu riche et au moins une division cellulaire en milieu minimum. Les cellules ont donc ainsi le temps de ségréger correctement, minimisant les colonies sectorisées, comptées sur boîte par la suite (Valens et al., 2004). Deux jours après étalement, le pourcentage de résolution est déterminé par le comptage des colonies blanches et des colonies bleues obtenues (figure 5B). En effet, le pourcentage de colonies blanches ayant perdu le senseur topologique reflète l’efficacité de résolution par la résolvase ɤδ, mesurant la densité de surenroulement. L’expérience est réalisée en triplicat, au moins deux fois.

La réaction de résolution peut être disséquée en trois étapes, d’échelle de temps différentes (Oram et al., 1997). La première étape est la plus rapide : le dimère se fixe à tous les sous- sites en quelques millisecondes, in vitro à 25 °C. Puis la formation de la synapse par juxtaposition des sites res est la seule étape qui nécessite le surenroulement pour la résolvase de γδ : elle se forme par glissement et migration de branchement de l’ADN et dure environ 1 seconde. La dernière étape, qui consiste en la coupure et l’échange des brins d’ADN par la résolvase, est la plus lente, requérant 10 secondes à 1 minute. Comme cette réaction se réalise en quelques minutes, l’utilisation de la résolvase γδRes de demie-vie 4h pourrait brouiller l’analyse cinétique de la disparition de barrières topologiques, si celles-ci apparaissent ou disparaissent d’une phase de croissance à l’autre, donc en moins de 4 h après l’expression, en milieu riche. La version modifiée γδRes-SsrA-L9D présente une durée de vie moins longue. En effet, le tag SsrA de 11 acides aminés (AANDENYALAA), fusionné à l’extrémité C-terminale de la protéine, mène cette dernière à sa dégradation par le protéasome ClpX in vitro et in vivo (Gottesman et al., 1998). La substitution L9D ajuste la demi-vie de la résolvase γδ à 30 minutes en phase exponentielle de croissance chez E. coli et

S. typhimurium, sans sembler affecter ses propriétés enzymatique (Stein et al., 2005).

L’enzyme γδRes-SsrA-L9D pourrait donc sonder la dynamique du chromosome pendant 30 minutes en moyenne. Afin d’explorer les propriétés de ces deux résolvases de longue et courte durée de vie chez E. coli, on a souhaité comparer leur efficacité de résolution. L’expression de la résolvase γδRes sauvage mène à près de 99,5 % de létalité en phase exponentielle de croissance de milieu riche et à 64 % en milieu minimum. Aucune létalité n’est observée en phase stationnaire. A l’inverse, l’expression de la résolvase γδRes-SsrA-L9D n’a pas d’effet sur la survie des

resmats6res yoaC resmats6res LB Activité β-glucuronidase (Novel) Phase exponentielle Phase stationnaire yoaC Sans indu ctio n Indu ctio

n resmats6res yoaC resmats6res

Phase exponentielle Phase stationnaire

Activité β-glucuronidase (Novel)

MM A

pas seulement des différences dans la quantité intracellulaire de résolvase, nous avons analysé l’expression de la résolvase.

Celle-ci a été étudiée dans les deux types de constructions permettant de mesurer le surenroulement libre in vivo : la souche MG1657 comportant le senseur topologique à la position yoaC (Ter) et la souche MG1657resmatS6res. Un test β-glucuronidase a été utilisé pour rapporter l’expression induite par le promoteur thermo inductible λPL contrôlant

l’expression de la résolvase dans le pJBγδRes-SsrA-L9D. Le plasmide pcILG4, portant le gène rapporteur uidA qui code pour la β- glucuronidase sous contrôle du promoteur λPR, est

transféré dans les souches d’intérêt où l’on souhaite estimer l’activité du promoteur λPL

(Moulin et al., 2005). En effet, on considère que l’on peut extrapoler l’activité de λPR et à

celle du promoteur λPL étroitement lié. La β-glucuronidase hydrolyse le substrat

chromogène p-nitrophenyl β-D-glucuronide (NPG), et le produit de cette réaction peut être mesuré au spectrophotomètre à DO405nm. Cette activité reflète ainsi celle de λPR. Les

conditions d’induction sont identiques à celles du test de résolution : le contrôle sans induction correspond à la mesure de l’activité β-glucuronidase dans un aliquote de culture à 30°C, c’est à dire n’ayant pas subi d’induction du promoteur λPR (figure 6). Aucune différence n’est relevée entre les deux souches et l’activité β-glucuronidase mesurée à 30°C est faible par rapport à celle mesurée à 42°C, lorsque le promoteur λPR est actif, au moins en phase exponentielle. Cela indique que le promoteur λPR, et ainsi le promoteur λPL, seraient stablement réprimés par le facteur cI857 TS à 30°C. Par ailleurs, on remarque une grande variabilité d’expression en phase exponentielle pour les deux milieux. Lorsqu’il est induit, ce promoteur est plus actif en phase exponentielle qu’en phase stationnaire, d’un facteur 2 environ dans les deux milieux, comme cela a été observé chez S. thyphimurium (Higgins et al., 1996). II. Mesure du surenroulement libre du chromosome par le senseur topologique Afin de s’affranchir d’un éventuel effet de séquence génomique entre les deux sites res sur le test de résolution, le « senseur de supertours » a été utilisé en premier lieu pour évaluer l’état de surenroulement sur le chromosome. Ce système présente en effet deux avantages. D’une part, le module crée un espace inter-res de 9kb avec une faible activité transcriptionnelle interne sauf si les cellules sont mises en croissance dans un milieu

Figure 7 : efficacités de résolution promue par γδ-Res-SsrA-L9D du senseur topologique dans le chromosome d’Escherichia coli en phase exponentielle de croissance en milieu riche. Les différentes couleurs déterminent l’appartenance des positions aux macrodomaines Ori (vert), Right (rouge), Ter (turquoise) et Left (bleu).

Position sur le chromosome d’Escherichia coli Efficacité de

résolution (%)

contenant du lactose ou de l’IPTG (l’abondance de l’ARNm de lacZ produisant un ratio ARN/ADN inférieur à 0,7 (Bernstein et al., 2002). D’autre part, le senseur topologique étant une construction synthétique insérée dans le chromosome, l’efficacité avec laquelle les sites res sont résolus par la résolvase informe exclusivement du niveau de surenroulement libre à l’extérieur du senseur. 1) Variation locale du niveau de surenroulement diffusible Afin d’analyser le niveau du surenroulement libre à différents endroits du chromosome, le senseur topologique a été utilisé. Puisqu’il permet d’analyser l’efficacité de résolution en un point donné du génome, on peut alors comparer le niveau de surenroulement d’un loci à l’autre en déplaçant la cassette dans le chromosome. En outre, la distance pour laquelle la résolution diminue de 50% avec la résolvase γδRes-SsrA-L9D de demi-vie 30 minutes, est de 13kb chez S. thyphimurium (Stein et al., 2005). La distance inter-res étant de 9kb dans le module intégré à un locus du chromosome, le système est donc exposé suffisamment longtemps à la résolvase pour que la réaction de résolution ait lieu.

Douze insertions ont été réalisées, dont au moins une par macrodomaine et par région non structurée (figure 7). Celles-ci portent le nom du gène situé directement en 3’, tels rsmG dans le MD Ori, loiP dans le NSL, yedL dans le MD Left. On compte également deux insertions dans le macrodomaine Right, ybgA et efeU, ainsi que six insertions dans le macrodomaine Ter, yciI, osmB, uspE, uidC, yniA et enfin yoaC. Ces positions ont été sélectionnées parmi les 35 insertions de site parS réalisées dans le chromosome d’E. coli au laboratoire pour le suivi par FROS des macrodomaines au cours du cycle cellulaire (Espeli et al., 2008). Toutes ces insertions sont intergéniques, excepté une au sein du NSR dans le gène crl.

Afin de comparer les résultats à ceux d’une autre étude réalisée chez S. typhimurium, les expériences ont été faites en phase exponentielle de croissance en milieu riche, en utilisant la résolvase γδRes-SsrA-L9D. Contrairement à ce qui est observé chez S. typhimurium, le niveau de surenroulement varie considérablement d’un loci à l’autre. Aucune concordance n’est observée entre l’organisation en macrodomaines ou en région non structurée et le niveau de surenroulement. Certains points présentent même un niveau de résolution presque nul, comme uspE, yciI ou yniA dans le macrodomaine Ter, à 0,2%, 1% et 2% respectivement. A l’inverse, d’autres positions, telles efeU dans le NSL ou loiP dans le

DO _600nm Efficacité de résolution (%) Figure 8 : évolution de l’efficacité de résolution promue par la résolvase γδ-Res-SsrA-L9D du senseur topologique dans l’Ori et le Ter, dans le chromosome d’E. coli au cours de la croissance en milieu riche.

macrodomaine Right, présentent un fort taux de résolution, de 59% et 88% respectivement. Sur douze points, sept présentent un taux de résolution inférieur à 10%. De la même façon, l’écart-type varie indépendamment du niveau de résolution. 2) Variations de la diffusion du surenroulement suivant les conditions de croissance La littérature décrit une augmentation du surenroulement suivant la croissance (Dorman et al., 1988). Le surenroulement total étant réparti de faon équivalente entre le surenroulement diffusible et le surenroulement contraint, il était intéressant d’étudier si cette augmentation s’applique au surenroulement libre.