Les variations locales du niveau de surenroulement diffusible

En plus des variations globales, mes résultats mettent en évidence des différences locales de niveau de surenroulement diffusible. On peut poser plusieurs hypothèses quant à l’origine de cette variabilité locus-dépendante, parmi lesquels le métabolisme de l’ARN. Très récemment, l’effet de la position chromosomique sur la variation d’un facteur 300 du niveau d’expression transcriptionnel a été mis en évidence chez E. coli (Bryant et al., 2014). Les auteurs n’ont pu établir de lien entre ces variabilités d’expression et le niveau du surenroulement de l’ADN. Cependant, seul le surenroulement total a été analysé. Mon travail montre que la transcription joue un rôle prépondérant dans la diminution de la diffusion du surenroulement sur le chromosome d’E. coli, notamment en phase exponentielle de croissance. D’après le twin model (Liu and Wang, 1987), un gradient de surenroulement est observé entre l’avant surenroulé positivement et l’arrière de la fourche de transcription surenroulé négativement. Aussi, la transcription agit sur une courte échelle génomique, le surenroulement diffusant à seulement 1,5 kb en amont du gène transcrit chez l’homme (Kouzine et al., 2013). On devrait donc s’attendre à une différence de densité de surenroulement en fonction de l’orientation de la transcription des gènes. L’efficacité de résolution du senseur topologique devrait être maximale entre deux gènes divergents où le surenroulement négatif en aval de chaque complexe de transcription se superpose, et minimal entre deux gènes convergents. Chez S. thyphimurium (tableau 2) et E. coli (tableau

3), aucune correspondance n’est trouvée entre la direction de la transcription et le taux de

résolution (tableau 2). En revanche, on semble trouver une relation entre le taux de résolution et la longueur du transcrit en tandem chez E. coli (figure 41). En effet, les transcrits les plus longs semblent montrer les taux de résolution les plus importants (ybfD,

putP). D’autres facteurs liés à la transcription pourraient donc augmenter les différences

locales du niveau de surenroulement diffusible, comme les protéines qui courbent l’ADN pour réguler l’activation transcriptionnelle ou encore des facteurs de modification post- transcriptionnelle. La transcription et la traduction semblant découplées chez B. subtilis et E.

coli (Lewis et al., 2000; Nevo-Dinur et al., 2011), on peut alors supposer que l’interaction du

transcrit avec des chaperonnes comme Hfq (Hoch and Hartmann, 2014), avec les filaments du cytosquelette en charge de son transport actif (Nevo-Dinur et al., 2011) ou avec le dégradosome ancré dans la membrane (Strahl et al., 2015), pourrait influencer la diffusion du surenroulement de l’ADN. Aussi, un lien direct semble exister entre la transcription et la dégradation (Chen et al., 2015) et la durée de vie des ARNm augmente en phase stationnaire : elle serait de 4 et 8 min environ pour les phases exponentielle et stationnaire respectivement (Bernstein et al., 2002; Chen et al., 2015; Esquerré et al., 2014). Il a été montré que l’hyper surenroulement négatif entraine la létalité des cellules par dégradation précoce des ARNm (Baaklini et al., 2008). Le degradosome composé de la RNaseE (endoribonuclease E), de RhlB (ARN helicase B), de la PNPase (phosphorylase polynucleotide) de Eno (enolase) et de la RNase II (exoribonucléase) étant essentiel pour assurer le turnover des ARNm (Bernstein et al., 2002), il serait intéressant d’étudier l’effet de l’inactivation de ses différents composants sur la diffusion du surenroulement. Aussi, l’analyse du profil topologique du chromosome à haute densité permettrait d’explorer ces différentes hypothèses portant sur le rôle du métabolisme de l’ARN dans la diffusion du surenroulement. 3) Comparaison des résultats obtenus avec d’autres études et systèmes de mesure du surenroulement diffusible Des essais avec d’autres systèmes de résolution de type excisionase tel la résolvasoue Sin n’ayant jamais été testée in vivo (Mouw et al., 2010) ou celle de Tn21 (Castell and Halford, 1989), ont été réalisés au laboratoire en utilisant le même système d’expression inductible et se sont avérés infructeux. Le mécanisme de résolution de ces enzymes a été largement

parmi lesquelles l’extrusion de cruciformes (McClellan et al., 1990) les promoteurs surenroulement dépendants tels les promoteurs PGyr/PLac (Miller and Simons, 1993; Moulin et al., 2005). Il est intéressant de noter que trouvons des résultast similaires à ceux obtenus par les expériences d’extrusions de cruciformes : l’augmentation du NaCl extracellulaire en milieu pauvre, et le mécanisme de la transcription provoquent une diminution de la diffusion du surenroulement. A l’inverse, nos résultats ne concordent pas avec la conclusion d’une absence de variation de la diffusion du surenroulement obtenue par les expériences d’activité des promoteurs PGyr/PLac. Il semblerait qu’un tel outil soit trop peu sensible pour capter de telles variations. IV. Domaines et barrières topologiques Le but de ma thèse a été d’étudier la topologie du chromosome d’E.coli à divers endroits du chromosome, mais aussi à l’échelle des organisateurs de la chromatine ou des déterminants de macrodomaine, afin de mettre en évidence des barrières topologiques notables. 1) Comparaison du niveau de surenroulement de E. coli et de S. thyphimurium a) Interactions à longue distance Lorsque la résolvase Tn3 sature son substrat in vitro, aucune dépendance à la distance inter- sites res espacés de quelques kilobases n’est relevée (Benjamin et al., 1985). L’insertion de site res indépendants dans le chromosome de S. typhimurium a permis d’évaluer l’effet de la distance in vivo entre sites res sur leur efficacité de leur résolution promue par la résolvase γδRes WT. Elle dépend de la distance séparant les sites suivant un système de pseudo premier ordre, comparable à la décroissance radioactive (Higgins et al., 1996). Dix minutes d’induction du système pJBγδRescI mènerait à un ratio d’enzyme par site res de 2000 :1 (Bliska et al., 1991). En supposant que la résolvase n’est ainsi pas limitante pour effectuer la réaction dans la cellule, c’est à dire correspondant à un ratio de monomère par site res d’au moins 20:1, la diminution de la communication observée ne peut provenir de l’apparition de barrières topologiques physiques (complexe enzymatique ou NAP bloquant la diffusion du surenroulement) ou énergétiques (absence de plectonème). L’adaptation de ce même test de résolution au chromosome d’E. coli montre le même effet de distance dans la région Ter (figure 42). En représentant les efficacités de résolution (y) en fonction des distance inter-res (x) testées avec la résolvase γδRes WT en conditions de faible variation d’expression de la

Efficacité de résolution (%) Distance inter res (kb) E. coli S.thyphimurium Figure 42 : représentation graphique de l’efficacité de résolution promue par la résolvase γδRes WT en fonction de la distance inter-res sur le chromosome d’E. coli ou de S. thyphimurium, en phase stationnaire de milieu riche.

résolvase (en phase stationnaire de milieu riche), on obtient également un système de pseudo premier ordre tel que y = 116.e-0,028x = 116.10-0,012x. Il est très intéressant de noter que le coefficient directeur de la pente de la courbe associée est identique à celui du système décrit chez S. thyphimurium dans les même conditions (y=146.10-0,013x = 146.e-0,032x). L’efficacité de résolution diminuerait de 50% tous les 25kb environ chez E. coli, contre 22 kb chez S. thyphimurium dans les mêmes conditions, indiquant une diffusion du surenroulement similaire entre ces deux organismes. Or, la densité moyenne de supertours (σ) mesurée sur plasmide en phase exponentielle de croissance chez E.coli est de 13% supérieure à celle relevée chez S. thyphimurium (Champion and Higgins, 2007). En comparant le facteur multiplicateur des deux droites, on observe une différence de 20%, similaire à la différence de surenroulement total constatée. Il semble donc que cette différence de surenroulement soit due principalement à une différence de surenroulement contraint qui serait supérieure chez E. coli. Le coulissement de plectonèmes chez E. coli peut rapprocher deux sites espacés jusqu’à 264 kb, indiquant que les barrières topologiques sont aléatoires. Aussi, comme chez S. thyphimurium, il est peu probable que les microdomaines fixes définis par Sinden et Pettijohn, dont la taille ne dépasse pas 100 kb, soient majoritaires dans le chromosome d’E. coli.

Ce système de mesure du surenroulement libre a initialement été mis au point avec la résolvase de Tn3 sur plasmide chez E. coli, ou sur le chromosome chez S. typhimurium (Bliska et al., 1991; Higgins et al., 1996). La capacité du système γδ à mesurer le surenroulement diffusible repose donc principalement sur des études in vitro et in vivo réalisées principalement sur la résolvase de Tn3. Bien que ces deux enzymes soient fonctionnellement interchangeables, présentant 78% d’homologie dans leur séquence et leur site cible, les résolvases de γδ et de Tn3 se différencient pour leur stringence au surenroulement : contrairement à celle de Tn3, la résolvase de γδ ne dépend du surenroulement négatif que pour la formation de la synapse (Benjamin et al., 1996). Ainsi, dans ce travail où le système γδRes a été adapté à E. coli, la diminution d’efficacité d’excision correspond strictement à une diminution de la fréquence d’interaction des deux sites par la résolvase. On a en effet montré que le test de résolution est sensible à l’inhibition de l’ADN gyrase par la novobiocine chez E. coli. Outre les effets pléiotropiques dûs au traitement à la novobiocine, on peut supposer que la diminution de l’appariemment des deux sites res in vivo dépend de l’activité de l’ADN gyrase, comme cela est observé chez S. thyphimurium. Cette diminution

Figure 43 : représentation graphique de l’emplacement des sites BIMEs sur le chromosome d’E.

coli. Le nombre de points dans chaque type de BIME correspond au nombre d’unité palindromique

de l’efficacité de résolution s’explique par une baisse de la densité de supertours dépendants de l’activité de l’ADN gyrase mais également par des barrières topologiques sous forme de topoisomérases de types II capturant des sites cibles (Staczek and Higgins, 1998). b) La diffusion du surenroulement dans la région de terminaison de la réplication L’état du surenroulement dans la région de terminaison de la réplication du chromome de S. thyphimurium n’a pu être analysée qu’en un seul point topologique (Rovinskiy et al., 2012). Il a pu être étudié plus en détails chez E. coli grâce à l’insertion du senseur topologique à six loci, espacés de 33 kb, 55 kb, 294 kb, 117 kb et 86 kb respectivement, et de part et d’autre du site de résolution des dimères de chromosomes dif. La densité de surenroulement dans cette région est aussi variable que dans les autres régions du chromosome, confirmant que l’organisation en macrodomaine n’est pas liée à l’organisation du surenroulement. Cependant, le taux de résolution y semble un peu plus faible que dans le reste du chromosome, comme ce qui a été observé chez S. thyphimurium. Cela peut s’expliquer de deux façons. D’une part, la région Ter est la cible de nombreux mécanismes concomittants, tels la fin de la réplication, la caténation des chromatides sœurs, la cohésion des macrodomaines Ter par MatP au divisome, suivie de la ségrégation des nucléoïdes impliquant la translocationde FtsK et résolution des dimères de chromosome par les recombinases XerCD au site dif. Tous ces processus mettent en jeu des interactions protéines-ADN, supportées par les analyses bio-informatiques qui montrent que la région Ter est hautement courbée et peu déformable par rapport aux autres régions (Pedersen et al., 2000). Or, l’insertion d’une région courbée diminue de 50% la dynamique interne de l’ADN surenroulé sur plasmide in vitro (Kremer et al., 1993). Ceci serait dû à la réduction de l’espace configurationnel accessible pour le supertour en mouvement. De plus, la translocation de FtsK sur l’ADN induirait du surenroulement positif dans la région Ter (Lionnet et al., 2006). D’autre part, il a été remarqué qu’une certaine catégorie de palindrome extragénique répété (REP), les BIME de type 2, est absente de la région Ter (figure 43) (Bachellier et al., 1994). Ces sites seraient reconnus par l’ADN gyrase (Espéli and Boccard, 1997) et par la transposase TnpAREP. Une étude récente a montré que le petit ARN non codant nc5 s’hybride spécifiquement aux sites BIMEs-2, au moyen de HU, ayant pour effet de condenser l’ADN (Macvanin et al., 2012). Or, les positions loiP et efeU où la

résolution est élevée, sont à 1 et 3 kb respectivement de ces sites, tandis que les loci du Ter sont les plus éloignés (100 à 300 kb). Il serait donc très interessant de tester l’effet de la suppression de ces sites sur la résolution.