PrŽparation des prŽlvements

Du fait du caractre polymicrobien des expectorations et des aspirations bronchiques, une Žtape de fluidification-dŽcontamination a ŽtŽ nŽcessaire. La technique utilisŽe au laboratoire de bactŽriologie du CHU de Rouen (dŽnommŽ Ç MŽthode A È par la suite) est rŽservŽe aux prŽlvements provenant de patients mucoviscidosiques. CÕest celle recommandŽe par l'ATS (Griffith, 2007).

MŽthode A : mŽthode conventionnelle avec une double dŽcontamination

Cette mŽthode consiste en une double dŽcontamination (DD) : une solution de Mycoprep¨ (contenant un agent mucolytique, la N-acŽtylcystŽine [NAC], et un agent dŽcontaminant, la soude [NaOH]) a ŽtŽ mise en contact 15 minutes sous agitation avec un volume Žgal de prŽlvement. La dŽcontamination a ŽtŽ stoppŽe par du tampon phosphate pH=6.8, ajoutŽ jusquՈ un volume de 50 ml. Le tout a ŽtŽ centrifugŽ 20 minutes ˆ 4000 trs/min. Aprs avoir ŽliminŽ le surnageant, 1 ml dÕeau et dÕacide oxalique ˆ 5% ont ŽtŽ mis en contact 15 minutes sous agitation avec le culot de centrifugation. LÕacide a ŽtŽ neutralisŽ par de la soude ˆ 4%. Ensuite, la rŽaction a ŽtŽ stoppŽe par lÕajout de tampon phosphate (jusquՈ 50 ml) puis le mŽlange a ŽtŽ centrifugŽ (20 minutes), le surnageant ŽliminŽ et le culot repris par 1 ˆ 2 ml de tampon phosphate.

MŽthode B : essai dÕune nouvelle technique de fluidification-dŽcontamination

Cette technique de dŽcontamination a ŽtŽ testŽe, en parallle de la mŽthode conventionnelle A, de fŽvrier ˆ avril 2012, quand le volume de prŽlvement Žtait suffisant.

Cette mŽthode est basŽe sur lÕutilisation dÕun antiseptique : la chlorhexidine (Ch) (mŽthode de Peres, Gevaudan, Gulian et de Micco). Elle se diffŽrencie de la mŽthode A par son temps de rŽalisation plus court (1h vs 1h30 pour la mŽthode A) et ne nŽcessite quÕune Žtape de dŽcontamination.

Le prŽlvement a ŽtŽ fluidifiŽ par 2 ml de dithiothrŽitol pendant 15 minutes sous agitation. La dŽcontamination a ŽtŽ rŽalisŽe par lÕajout de 6 ml de chlorhexidine ˆ 1%, lÕensemble Žtant agitŽ pendant 15 minutes. La neutralisation a ŽtŽ rŽalisŽe, comme pour la mŽthode A, par lÕajout de tampon phosphate pH=6.8 jusquՈ un volume de 50 ml puis centrifugŽ pendant 20 minutes. Le culot est repris par 1 ml de tampon phosphate.

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3.

Examen microscopique des frottis

LÕexamen direct nÕa ŽtŽ effectuŽ que pour les patients connus antŽrieurement avec une culture positive de MNT pathogne ˆ partir de leurs prŽlvements respiratoires.

LÕexamen microscopique a ŽtŽ effectuŽ ˆ partir du culot du produit respiratoire homogŽnŽisŽ et centrifugŽ aprs un traitement fluidifiant-dŽcontaminant. Le frottis, fixŽ par la chaleur et lÕalcool mŽthylique, a ŽtŽ colorŽ par deux mŽthodes : la coloration ˆ lÕauramine puis, pour les frottis positifs, par la coloration de Ziehl-Neelsen.

Coloration ˆ lÕauramine

Le frottis a ŽtŽ recouvert par une solution dÕauramine pendant 15 minutes puis recouverte dÕalcool-acide (mŽlange dÕalccol ˆ 95¡ et dÕacide chlorhydrique) pendant 5 minutes. La contre- coloration a ŽtŽ rŽalisŽe par du rouge de thiazine pendant 1 minute et 30 secondes. La lame a ŽtŽ rincŽe ˆ lÕeau distillŽe entre les diffŽrentes Žtapes avant dՐtre sŽchŽe ˆ lÕair et ˆ lÕabri de la lumire. La lecture a ŽtŽ effectuŽe ˆ lÕobjectif x40 ˆ sec et avec un microscope ˆ fluorescence. La lame entire a ŽtŽ examinŽe ˆ la recherche de b‰tonnets fluorescents sur fond rouge foncŽ.

Coloration de Ziehl-Neelsen

En cas d'examen direct positif ˆ l'auramine, nous avons confirmŽ la positivitŽ du frottis par recoloration de la lame par le technique de Ziehl-Neelsen : la lame a ŽtŽ recouverte pendant 10 minutes de fuschine phŽniquŽe ˆ chaud ; la dŽcoloration a ŽtŽ rŽalisŽe ˆ lÕaide dÕacide sulfurique ˆ 25% pendant 3 minutes puis par de lՎthanol 90¡ pendant 5 minutes. La lame a ŽtŽ rincŽe entre chaque Žtape puis sŽchŽe ˆ lÕair. La contre-coloration a ŽtŽ rŽalisŽe avec le bleu de mŽthylne pendant 30 secondes. La lame a ŽtŽ ensuite observŽe ˆ lÕimmersion ˆ lÕobjectif x100 ˆ la recherche de bacilles rose-rouge sur fond bleu.

Les rŽsultats de lÕexamen microscopique ont ŽtŽ exprimŽs selon le Tableau 9, adaptŽes des recommandations du RŽmic¨ (Courcol, 2010).

RŽsultats rendus

Aucun BAAR dŽtectŽ Nombre exact de BAAR (5-10 vus) < 1 BAAR/champ 1 -10 BAAR/champ 10 - 100 BAAR/champ >100 BAAR/champ

Tableau 9 : ModalitŽs de rŽponse pour la lecture des examens microscopiques

4.

Mise en culture des prŽlvements

Le culot des prŽlvements dŽcontaminŽs a ŽtŽ ensemencŽ en milieu liquide et solide selon les recommandations de lÕATS (Griffith, 2007). Seule la technique A a permis lÕensemencement en milieu liquide ; la chlorhexidine utilisŽe dans la mŽthode B ne se dissolvant pas correctement dans ce milieu.

o _{Milieu solide}

L'ensemencement en milieu solide a ŽtŽ rŽalisŽ sur des milieux de Lšwenstein-Jensen (Bio- Rad) en inoculant 4 ˆ 5 gouttes du culot de prŽlvement par tube. Le nombre de tubes ensemencŽs a variŽ en fonction de la mŽthode de dŽcontamination utilisŽe et en fonction des antŽrioritŽs de cultures positives pour le patient (Tableau 10).

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MŽthode A MŽthode B

Patients connus 4 milieux 2 milieux

Patients non connus 2 milieux 2 milieux

Tableau 10 : Nombre de milieux solides ensemencŽs

Ceux-ci ont ŽtŽ incubŽs en position inclinŽe, un ou deux ˆ 30¡C et un ou deux ˆ 37¡C. La lecture des tubes a ŽtŽ faite manuellement une fois par semaine.

En cas de cultures positives, nous avons relevŽ le dŽlai dÕapparition des colonies, leur nombre, leur aspect et la prŽsence ou non dÕune pigmentation. En cas de croissance de contaminants sur le milieu, la culture a ŽtŽ interrompue. Le tube a ŽtŽ jetŽ et la notion de Ç tube souillŽ È a ŽtŽ notŽe.

o _{Milieu liquide}

Un tube BBLTM MGITTM (Becton Dickinson) a ŽtŽ ensemencŽ avec 0,5 ml du culot de centrifugation des prŽlvements dŽcontaminŽs par la mŽthode A. Ont ŽtŽ ajoutŽs 800 µl dÕun mŽlange d'antibiotiques PANTA¨ (Polymixine B, AmphotŽricineB, acide Nalidixique, TrimŽthoprime, Azlocilline) et de facteurs de croissance OADC¨ (acide OlŽique, Albumine bovine, Dextrose, Catalase).

La croissance a ŽtŽ rŽvŽlŽe ˆ lÕaide de lÕautomate BACTECTM MGITTM 960 (Becton Dickinson). L'incubation des tubes dans l'automate a ŽtŽ rŽalisŽe ˆ 37¡C jusqu'au signal de croissance et pour une durŽe maximale de 42 jours.

En cas de culture positive, nous avons notŽ le dŽlai dÕapparition de la positivitŽ et vŽrifiŽ aprs coloration de Ziehl-Neelsen que les micro-organismes qui sՎtaient dŽveloppŽs dans le milieu Žtaient bien des BAAR et non des contaminants. Suite ˆ cette vŽrification, une subculture sur milieu de Lšwenstein-Jensen a ŽtŽ faite. En cas de prŽsence de contaminant, une nouvelle dŽcontamination du tube MGITTM Žtait rŽalisŽe pour tenter dÕisoler une mycobactŽrie.

Afin dÕaugmenter la sensibilitŽ de dŽtection du milieu MGITTM, lorsque lÕautomate a rendu une culture nŽgative, nous avons effectuŽ un contr™le visuel du milieu MGIT comme suggŽrŽ dans certaines publications (Pena, 2012). La prŽsence de petits grains au fond du tube (Figure 34) peut en effet indiquer la prŽsence de mycobactŽries.

Figure 34 : Aspect typique de mycobactŽries dans un MGIT nŽgatif (Pena, 2012)

o _{Essai du milieu de culture Cepacia}¨

Le prŽlvement a ŽtŽ ensemencŽ sur un milieu Cepacia¨ (AES Chemunex) sans Žtape prŽalable de dŽcontamination. Le prŽlvement a juste ŽtŽ diluŽ au demi dans du Digest-EUR¨ (Eurobio) pour le fluidifier avant sa mise en culture.

Ce milieu a ŽtŽ incubŽ 5 jours ˆ 37¡C puis ˆ 30¡C jusquÕau 14me jour dÕincubation. Il a ŽtŽ regardŽ tous les 2-3 jours. En cas de positivitŽ, le dŽlai de culture ainsi que lÕaspect lisse ou rugueux des colonies de mycobactŽries ont ŽtŽ relevŽs (Figure 35).

Figure 35 : Aspect des colonies sur milieu Cepacia¨

82

5.

Identification des cultures positives

a. MŽthode phŽnotypique

Quelques caractres phŽnotypiques ont ŽtŽ relevŽs ˆ partir des colonies des milieux Lšwenstein-Jensen :

_ la morphologie des BAAR en microscopie _ le dŽlai de culture des colonies

_ lÕaspect lisse (S) ou rugueux (R) des colonies

_ la pigmentation des colonies ˆ la base de la classification de Runyon

b. MŽthode gŽnotypique

En parallle, lÕidentification a ŽtŽ rŽalisŽe gr‰ce ˆ lÕamplification par PCR dÕun fragment du gne hsp65 ˆ partir du milieu de culture liquide ou de colonies.

La procŽdure complte comporte quatre phases :

o _{extraction de lÕADN ˆ partir de cultures de mycobactŽries cultivŽes en milieu} solide ou liquide

o _{amplification gŽnique en temps rŽel sur ABI PRISM}¨ _{7000 (Applied Biosystems)} ˆ partir des amorces 102A1 et 102A2

o _{sŽquenage du fragment hsp65 amplifiŽ}

o _{analyse des sŽquences par confrontation ˆ la base de donnŽes BIBI (Bio} Informatic Bacterial Identification) permettant d'identifier la souche et lՎdition dÕun dendrogramme (Figure 36).

Figure 36 : Dendrogramme montrant les relations gŽnŽtiques des souches de mycobactŽries selon les sŽquences du gne hsp65

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B. Etude rŽtrospective des cas dÕinfections dues aux