Paramètres d‘activité biologique

II.2.1. Activités enzymatiques

Les enzymes sélectionnées dans cette thèse ont été choisies pour représenter les principales voies de dégradation de la matière organique. L‘activité globale a été dosée par mesure de l‘hydrolyse de la fluorescéine diacétate (FDA). Ce substrat pouvant être hydrolysé par un grand nombre d‘enzymes comme les protéases, les estérases, les lipases, et sa dégradation permet d‘avoir une mesure des activités enzymatiques globales dans les sols (Green et al. 2006). Deux enzymes étudiées sont impliquées dans le cycle de l‘azote : la leucine amino-peptidase et l‘uréase. La phosphatase alcaline (cycle P) et trois enzymes impliquées dans le cycle du carbone (la cellobiohydrolase, les laccases et la ß glucosidase) ont également été suivies. La mesure des différentes activités a été adaptée de protocoles existants, l‘activité des laccases a été mesurée d‘après Floch et al. (2007) le protocole pour les

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activités des cellulases, β glucosidase, phosphatase alcaline et leucine aminopeptidase a été adapté à partir de (Marx et al. 2001). La mesure de l‘uréase s‘est opérée selon (Sinsabaugh et al. 2000, Klose and Tabatabai 1999). Les activités enzymatiques ont été mesurées pour un premier essai fin août 2010 puis lors du prélèvement T1 à T4 sauf pour les deux enzymes impliquées dans le cycle de l‘azote, dont l‘activité a été suivie aux trois derniers temps seulement (T2, T3 et T4). Les mesures d‘activités biologiques des parcelles d‘Amagne (TTCR et BE) n‘ont pas été réalisées à T3. L‘ensemble des enzymes étudiées ainsi que les produits utilisés pour le dosage de leurs activités sont décrits dans le tableau 2.3. Pour chaque sol, des essais ont été réalisés pour travailler en concentrations saturantes de substrats (figure 2.6).

Figure 2.6 : Courbe permettant de définir les concentrations saturantes en substrat pour l’activité d’hydrolyse de la FDA dans les sols du site de Semuy.

Des essais ont également été réalisés pour adapter le temps d‘incubation des mesures d‘activité uréase et phénol-oxydase. L‘activité des autres enzymes a été suivie sur des cinétiques de 6h minimum. L‘activité est calculée avec la pente, en phase linéaire de la courbe (concentration de fluorochrome = f(temps)). Nous utilisons ici, pour les activités enzymatiques, des conditions optimales de température et pH, tout en restant à l‘humidité in

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0 4 8 12 16 Fl u o re sc é in e r e lar gu é e µ g/ mi n /p u it

Concentration de substrat (FDA) µg/puit

Bande enherbée Semuy Semuy

Agrosystème Forêt

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situ pour prendre en compte la variabilité des différents usages du sol dans le maintien de l‘humidité de l‘horizon de surface. La mesure des activités s‘effectue de la façon suivante : les sols utilisés sont conservés à 4°C. Avant chaque mesure, des suspensions de sols sont réalisées : 2.5 g de sol frais sont suspendus dans 50 mL de tampon approprié pour chaque enzyme (Annexe 3: Tampons utilisés pour les mesures d‘activité Enzymatique) puis agités dans un agitateur orbital (Stuart Scientific SI50) à 250 rpm pendant 10 min. Ils sont ensuite soniqués pendant 2 min (la sonication permet de solubiliser les enzymes fixées au complexe argilo-humique ou simplement à la fraction minérale du sol). Six replicats de mesure sont ensuite réalisés : un petit volume (25, 100 ou 400 µL en fonction des activités mesurées) de la suspension de sol est placé dans des microplaques à 96 puits (Greiner bio-one, Ref 655076 pour les activités mesurées par fluorescence ou Ref 655096, microplaques à fonds transparents pour les activités mesurées en absorbance). Pour finir, la solution de substrat est ajoutée. Les microplaques sont placées à l‘obscurité à 28°C. Les mesures de fluorescence sont réalisées toutes les heures avec un spectrophotomètre (Safas Monaco Xenius SP2000 XC). Les longueurs d‘ondes utilisées pour les mesures sont résumées dans le tableau 2.3. Un certain nombre de précautions ont été prises pour l‘ensemble des protocoles (De Forest 2009) : des témoins ont été préparés sans sol afin d‘évaluer la fluorescence non induite par le contact avec le sol. La conservation des échantillons de sol devant servir aux analyses enzymatiques s‘est toujours faite à 4°C et n‘a pas dépassé 2 semaines. L‘agitation et la sonication des suspensions de sol n‘ont jamais dépassé 20 min. Les solutions mères de standard et de substrat ont été refaites à chaque dosage. Les mesures d‘activités en fluorescences sont compatibles avec la norme afnor 2010, XP ISO/TS 22939. Les protocoles détaillés des mesures d‘activités enzymatiques sont présentés en annexe 4.

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II.2.1. Respiration basale

La respiration microbienne basale a été mesurée en suivant le protocole de Wardle et al. (1993) avec quelques modifications. Pour chaque échantillon de terrain, de T1 à T4 (114 échantillons, car Amagne et sa bande enherbée n‘ont pas été mesurés à T3) 3 réplicats de mesure étaient réalisés, par conséquent 342 flacons d‘incubation de mesure de respiration basale ont été mis en place. 25g de sol frais, laissés à l‘humidité in situ étaient placés dans un flacon d‘incubation stérile de 250 mL et fermé avec un bouchon en caoutchouc vissé avec une virole en aluminium. Les flacons étaient incubés à 28°C dans l‘obscurité pendant trois jours. La respiration basale : C-CO2 émis dans l‘atmosphère des flacons au cours de la minéralisation des matières organiques sans addition de glucose, était mesurée quotidiennement sur un prélèvement de 5 mL de ladite atmosphère, par spectrophotométrie infrarouge (BINOS 1004 Gaz analyser). La respiration microbienne est exprimée en mg C-CO2.h-1.g-1 de sol sec. Le CO2 absorbe les radiations IR à 2325.6 cm-1. Un coefficient de minéralisation des matières organiques est calculé avec le Corg des échantillons : les teneurs de CO2 sont transformées en taux de minéralisation du carbone (en ‰ du carbone organique total)

C − CO2 ‰ = CO2 vpm × 22.86 × ^{Vflacon (mL)}

1000 ^×

12 22.4 ^×

1

78 Tableau 2.3 : Enzymes extracellulaires étudiées, avec leurs substrats, standards et tampons correspondants pour contrôler leurs activités potentielles.

Enzymes Cycles EC Tampons Substrats Mesures (nm) Standards Référence

Laccase (Phenol Oxidases) Carbone EC 1.10.3.2 _{50 mM pH 5} ^Acetate 2,2'-azinobis-(-3 ethylbenzothiazoline-6-sulfononic acid) diamonium

salt ABTS (A1888)**

Absorbance 418

La quantité d'ABTS formée est mesurée avec

la loi de beer lambert (ε420 = 36 000 M-1 cm-1) Floch et al. 2007 adapté Cellulase EC 3.2.1.91 Phosphate 0.1M pH 7.5 MES 0,1M à PH 6 Trizma 0,05M à pH 8 4-MUB-β-D-cellobioside (M6018)** Flu or escen ce 330 exitation 450 emission 4-Methylumbelliferone (MUB) (M1381)** Marx et al. 2001 adapté ß Glucosidase EC 3.2.1.21 ^{4-MUB-β-D-glucopyranoside} _(M3633)**

Phosphatase alcaline Phosphore EC 3.1.3.1 4-MUB-phosphate (M8883)** Leucine Amino-Peptidase Azote EC 3.4.11.1 _{methylcoumarin (L2145)**} L-Leucine-7-amido-4-342 exitation 440 emission 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) (A9891)**

Uréase EC 3.5.1.5 _ultrapure ^Eau Urée Absorbance 670 NH4Cl

Sinsabaugh et al., 2000 /

Klose & Tabatabaï,

1999. Hydrolyse de la FDA Activité globale EC 3.1.1.x

Potassium Phosphate 60 mM pH 7.6 Fluorescein Diacetate [3',6'-diacetylfluorescein (FDA)] (F7378)** ^Fluorescence 490 exitation 523 emission

Fluorescéine (F2456)** _{2006 adapté} ^{Green et al.} EC, enzyme commission classification; MUB,

methylumbelliferyl

* ε420 = 36 000 M-1 cm-1

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II.2.2. Nitrification Basale

La mesure de la nitrification basale a été réalisée sur les prélèvements de sol d‘automne 2010 (T1) et seulement sur les parcelles de Semuy et Givry (les deux TTCR et BE, ripisylve et agrosystème) à raison de 3 répétitions par échantillon, soit 54 mesures. Cinq g de sol sec de l‘horizon AP ou A, sont mis à incuber dans des flacons sérum de 250 mL fermés hermétiquement. L‘incubation est réalisée à l‘obscurité en conditions contrôlées : température 28°C et humidité 80% de la capacité au champ (ISO 11274) sur une période de 30 jours. Un témoin abiotique (autoclavé 2 fois à 24h d‘intervalle) est mis en place pour chaque type de parcelle. Tous les 7 jours, les flacons sont ouverts pendant 60 minutes pour renouveler l‘air et l‘humidité est ajustée. Les différentes formes d‘azote minéral (NO3-, NO2- et NH4+) ont été extraites et dosées (cf. II.1.2) à T0 et T30 jours. L‘azote minéral est exprimé en µg NO3^-1.g dry soil-1.day-1. Le taux de nitrification est calculé de la manière suivante : N-NO3^-/(N-NO3^- + N-NH4⁺) (%).