Matériel et méthodes

II.1. Description des sites

Les parcelles étudiées sont situées dans la vallée de l‘Aisne, dans les Ardennes. Le contexte pédoclimatique est décrit dans le chapitre 2 (§ I.2.1). Les parcelles de TTCR de saules étudiées sont localisées sur quatre sites : Semuy et Givry, où elles ont été plantées en 2006 sur des cultures de maïs et Asfeld et Amagne, où la plantation a été réalisée en 2008 sur des jachères (chapitre 2 § I.2.2). Le rendement en plaquettes obtenu avec les parcelles de Givry et Semuy a été de 24 et 22 tMS/ha/an en novembre 2008. Les rendements de ces deux parcelles ont diminué à la deuxième récolte (novembre 2011): 19.9 et 19.7 t/MS/ha/an. Les parcelles d‘Asfeld et Amagne ont été récoltées pour la première fois à cette date et ont produit respectivement 36.3 et 9.1 tMS/ha/an. Les caractéristiques physico-chimiques des sols des parcelles sont relativement similaires (tableau 5.1).

Tableau 5.1 : Caractéristiques des sols de surface (0-15cm) des parcelles de TTCR, des bandes enherbées (BE), de la forêt (F) et de l'agrosystème (A).

Semuy _Semuy ^BE F A Givry _{Givry Asfeld} ^BE _{Asfeld Amagne} ^BE _Amagne ^BE

Argiles (%) 49 50 56 32 41 39 59 58 71 71 Limons (%) 42 39 36 56 42 44 36 40 27 27 Sables (%) 9 11 9 12 17 16 4 2 1 1 pH (H2O) 7.6 7.3 7.5 7.7 7.6 7.4 7.3 7.3 6.6 7.4 pH (KCl) 6.8 6.7 7.0 7.6 7.0 6.8 6.8 6.7 5.7 6.8 CaCO3 (g.kg-1) 119 138 69 261 209 110 110 106 1 15

La texture est limono-argileuse pour l‘agrosystème et argilo-limoneuse pour toutes les autres parcelles. La somme des fractions fines (Argiles + Limons) est comprise entre 83 à 98 %. La parcelle de TTCR et la bande enherbée d‘Amagne ont des teneurs très faibles en carbonate.

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Le pH de cette parcelle de TTCR d‘Amagne (6.6) est plus faible que celui des autres sites, situé entre 7.3 et 7.7 (tableau 5.1). Dans ce chapitre, les quatre parcelles de saules sont comparées à leurs bandes enherbées voisines mais également à l‘agrosystème et à la forêt alluviale, situés sur le site de Semuy. Les trois sites Semuy, Givry et Asfeld, l‘agrosystème et la forêt sont localisés sur des sols tout à fait comparables et dans la même zone géographique et climatique de la vallée de l‘Aisne. Par ailleurs, l‘influence des particularités pédologiques du site d‘Amagne comparativement au trois autres sites, sera discutée dans ce chapitre.

II.2. Echantillonnage

L‘échantillonnage du sol et des racines a été réalisé de manière saisonnière (chapitre 2 § I.3). Cinq temps de prélèvements ont été réalisés : printemps 2010 (T0), automne 2010 (T1), printemps 2011 (T2), automne 2011 (T3) et printemps 2012 (T4). La forêt et l‘agrosystème n‘ont pas été échantillonnés à T0.

II.3. Analyses

II.3.1. Paramètres mesurés

La strate herbacée présente sur les différentes parcelles de TTCR a été observée lors de chaque échantillonnage. La hauteur moyenne des strates herbacées des parcelles de TTCR de Semuy, Givry et Asfeld et leurs biomasses aériennes ont été estimées à T3. Les paramètres mesurés aux différents temps sont présentés dans le tableau 5.2. L‘abondance des communautés microbiennes (bactérienne et fongique) a été mesurée par PCR en temps réel (chapitre 2 § II.3.1.d) et la structure de ces communautés par PCR-TTGE (chapitre 2 § II.3.1.b, II.3.1.c). Un indice de diversité de Shannon a été calculé à partir des données de TTGE des communautés fongiques (chapitre 2 § II.3.1.c).

Pour les champignons mycorhiziens à arbuscules, le nombre de spores dans le sol, et la colonisation mycorhizienne des racines ont été mesurés. Les protocoles d‘extraction de spores

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et de mesure des fréquences et d‘intensités de colonisation par les champignons mycorhiziens à arbuscules (MA) sont décrits dans le chapitre 2 (§ II.3.3). La structure des communautés de champignons mycorhiziens à arbuscules a été obtenue par PCR-TTGE à partir d‘ADN extrait de racines. Pour les parcelles de TTCR et la parcelle de forêt alluviale, ce sont des racines de saules dont l‘ADN a été extrait (chapitre 2 § II.3.3.a). Sur les bandes enherbées, ce sont les racines de diverses graminées qui ont été échantillonnées (fétuque, molinie etc.). Enfin, les racines prélevées sur l‘agrosystème et utilisées pour l‘extraction d‘ADN étaient des racines de blé. A partir des gels de TTGE, 27 bandes ont été prélevées, purifiées et séquencées pour définir la nature des communautés de champignons endomycorhiziens (chapitre 2 § II.3.3).

Tableau 5.2 : Ensemble des paramètres mesurés sur les communautés microbiennes et lombriciennes aux différents temps de prélèvements sur l’ensemble des parcelles. (MA: champignons mycorhiziens à arbuscules, ECM: champignons ectomycorhiziens)

T0 T1 T2 T3 T4

Densité fongique totale X X X X X

Densité bactérienne totale X X X X X

Structure des communautés fongiques X X X X X

Indice de Shannon des communautés fongiques X X X X X

Structure des communautés bactériennes X X

Structure des communautés de champignons MA X X X

Nombre de spores dans 20 g de sol X

Fréquence et intensité de colonisation MA X

Estimation visuelle de la colonisation ECM X X X * X X

Communautés lombriciennes X X

Hauteur moyenne et biomasse aérienne des strates

herbacées des parcelles de TTCR ^X

* en juin 2011, l'estimation a été complétée par une identification des apex observés à la loupe binoculaire

Pour les champignons ectomycorhiziens, les racines de saules des parcelles de TTCR d‘Asfeld, Semuy et Givry, ont été lavées et observées à la loupe binoculaire : un pourcentage approximatif de racines ectomycorhizées a été estimé. Une dizaine d‘apex ectomycorhizés des racines prélevées en juin 2011, regroupant les morphotypes différents observables à la loupe binoculaire a été prélevée. Ils ont été écrasés au piston et mis en suspension dans de l‘eau ultrapure stérile. Le mélange a été utilisé ensuite pour amplifier l‘ADN des apex mycorhizés.

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Les produits PCR ont ensuite été séquencés (après purification et dilution). Les séquences partielles d‘ITS ont ensuite été comparées aux bases de données GenBank grâce à l‘application BlastN (Chapitre 2 § II.3.2).

Enfin, l‘AITC, principe actif de la moutarde, a été utilisé pour extraire les vers de terre du sol: les détails de la méthode sont donnés au dans le chapitre 2 (§ II.3.4). Les vers de terre n‘ont pas été prélevés sur le site d‘Amagne à T3 (automne 2011). Les activités enzymatiques n‘ont pas été mesurées non plus à ce temps de prélèvement sur Amagne (cf. Annexe 4). Suite au printemps 2011 très sec, les saules de la parcelle de TTCR d‘Amagne semblaient morts, c‘est pourquoi les analyses sur tous les paramètres biologiques n‘ont pas été faites. Une bonne reprise des boutures au printemps 2012 a cependant conduit à des mesures complètes au dernier prélèvement sur le site d‘Amagne.

II.3.2. Statistiques

Quatre types d‘analyses de variance (ANOVA) à deux facteurs ont été réalisés dans ce chapitre. Des ANOVA ont été réalisées pour comparer une variable dépendante sur les différentes parcelles (G16S, H‘18S etc…) au cours du temps, les deux facteurs sont alors : parcelles, temps (ANOVA parcelles). Le deuxième type d‘ANOVA a comparé également une variable dépendante au cours du temps mais cette fois entre les TTCR et les BE. Les deux facteurs sont nommés dans ce cas : usages, temps (ANOVA usages). Un troisième type d‘ANOVA a comparé les sites entre eux : Semuy, Givry, Asfeld et Amagne (ANOVA sites). Dans ces deux derniers cas, l‘agrosystème et la parcelle de forêt n‘ont pas été pris en compte. L‘ensemble des tests et des conditions est précisé dans le chapitre 2 au paragraphe III. Le dispositif de parcelles de TTCR disponibles n‘a pas permis d‘isoler l‘effet de l‘âge des parcelles de celui des antécédents culturaux. Les deux parcelles de TTCR situées à Givry et à Semuy et plantées sur des cultures de maïs sont plus anciennes (plantation en mars 2006) que les parcelles de TTCR d‘Amagne et d‘Asfeld, plantées sur des jachères en mars 2008.

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Cependant, un quatrième type d‘ANOVA a été effectué regroupant les TTCR de Givry et Semuy et les TTCR d‘Asfeld et d‘Amagne permettant d‘isoler conjointement les effets du précédent cultural et de l‘âge des taillis (ANOVA antécédent). Les vers de terre du site d‘Amagne n‘ont été échantillonnés qu‘en automne 2010, la variance des paramètres lombriciens en fonction des usages du sol concernant ce site a donc été testé par une ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de Newman Keuls.

Deux types de matrices sont utilisés dans l‘analyse des structures des communautés (cf. chapitre 2 § III). Pour les communautés bactériennes et fongiques totales, des ACP ont été réalisées à partir des matrices issues de l‘analyse des gels de TTGE obtenus avec les ADNr bactériens et fongiques (n=24) et les variables correspondent aux nombres de bandes sur les profils de gels. Les observations correspondent alors à l‘intensité relative des bandes. Concernant les communautés endomycorhiziennes, les ADN amplifiés utilisés sont issus d‘une PCR nichée (chapitre 2, § II.3.1.b). Dans ces conditions, la variation d‘intensité des bandes observées dans le gel n‘est pas directement proportionnelle à l‘abondance des différents ribotypes présents dans l‘échantillon de départ. Par conséquent, la matrice issue de l‘analyse des gels est binaire et basée sur la présence et l‘absence des bandes. Des analyses de positionnement multidimensionnel (MDS) ont donc été appliquées pour visualiser la structure des communautés de champignons mycorhiziens à arbuscules (MA) (Heinemeyer et al. 2004). Des analyses factorielles discriminantes (AFD) et les distances de Fisher qui en découlent, sont utilisées pour tester la significativité des groupes observés sur les ACP illustrant les communautés bactériennes, fongiques et lombriciennes (chapitre 2 § III).

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