Objectif du projet de recherche

Les mécanismes sous-jacents au développement de la maladie d’Alzheimer n’ont toujours pas été élucidés et aucun traitement curatif n’est disponible à ce jour. Si la majorité des modèles expérimentaux actuels tentent de s’approcher de la pathologie humaine, ils présentent néanmoins des limites. En particulier, le développement de traitement thérapeutique contre la MA s’est heurté à de nombreux échecs, surtout lors du passage en phases cliniques de médicaments pourtant jugés efficaces sur les modèles animaux et cellulaires existants. Avec la découverte récente de la Reprogrammation cellulaire il est possible de réaliser des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), comparables aux cellules souches embryonnaires humaines (hESC), à partir de fibroblastes de patients atteints de MA. Ces cellules sont génétiquement identiques aux cellules du donneur et ont la capacité de s’auto-renouveler et de se différencier en tous types de cellules. Cette technologie offre ainsi la possibilité unique d’obtenir en culture des neurones humains porteurs de la maladie et d’accéder à une modélisation ex vivo de la MA. Par ailleurs, comme nous l’avons détaillé en introduction, une étude a récemment mis en évidence la pertinence d’un système de culture en trois dimensions (3D) pour modéliser la MA. En effet, seule une différenciation neuronale en système 3D semble conduire à une maturation neuronale suffisante pour voir apparaître des plaques amyloïdes et des neurofibrilles qui sont les deux caractéristiques majeures retrouvées dans le cerveau des patients atteints de MA. Toutefois, cette étude a été réalisée à partir de lignées de progéniteurs neuraux immortalisés, surexprimant deux protéines APP et PS1 impliquées dans la MA et hébergeant des mutations retrouvées dans les formes génétiques de MA. Dans ce contexte, mon projet de thèse a pour objectif de générer, caractériser et proposer un nouveau modèle expérimental reproduisant et respectant le plus possible la physiopathologie des neurones de patients MA en alliant ces deux nouvelles technologies : la reprogrammation cellulaire et la génération de réseaux neuronaux en 3D. En produisant des iPSC issues de patients atteint de MA nous disposons ainsi d’un système cellulaire d’un intérêt majeur pour l’étude de la MA. Au-delà de l’intérêt d’avoir de tels modèles disponibles pour la communauté scientifique, nos objectifs spécifiques sont de (i) déterminer les mécanismes moléculaires des métabolismes des protéines APP et Tau, protéines faisant l’objet de nombreuses études de la maladie, ainsi que (ii) l’effet de leur modulation dans des cellules neurales en

situation pathologique. Pour mener à bien ce projet nous avons généré des lignées d’iPSC-MA issues de fibroblastes de patients atteints de formes familiales ou sans mutation causale associée à la MA ainsi que des hESC de référence. Les iPSC-MA, iPSC témoins et hESC différenciées en cellules souches neurales puis en neurones apporteront de nombreuses informations quant à l’impact des mutations (Figure 74).

Figure 74 : Schéma récapitulatif des approches expérimentales abordées au cours du projet de thèse pour modéliser et étudier la maladie d'Alzheimer.

Chapitre VI.

Modélisation de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer dans les cellules souches pluripotentes induites.

Modeling The Alzheimer’s disease physiopathology in induced pluripotent stem cells (iPSC)

Auboyer L.1, Lehmann S. 1,2, Gabelle-Deloustal A. 1,2 and Crozet C. 1

Affiliations :

1Institut de Médecine Régénératrice et de Biothérapie (IRMB), Montpellier, France

2CHU Montpellier, 80 rue Augustin Fliche 30295 Montpellier, France

Abstract

The mechanisms underlying the onset of Alzheimer’s disease (AD) have not yet been elucidated and there is no successful therapeutics yet. For several years, studies focused on the pathological processes in AD have been limited by the lack of accurate models until the recent groundbreaking of S. Yamanaka’s discovery with the generation of induced pluripotent stem cells (iPSC). So far, research has focused on the production and differentiation of iPSC into functional neurons toward the application in a large number of pathologies. This represents a unique opportunity to use iPSC as a method for modelling AD phenotype in vitro and to provide new insights into the causes and treatments of the disease. Modeling AD is still in its infancy with only few research papers reporting successful generation and characterization of iPSC-derived neurons from patients with AD. However, iPSC lines already cover sporadic forms and the main mutations of Familial Alzheimer’s disease (FAD) on the Amyloid Protein Precursor or Presenillins. In this review, we report the key aspects of the disease and discuss the capacity of existing models with emphasis on iPSC to fully recapitulate the hallmarks of the disease.

Les mécanismes sous-tendant l’apparition de la maladie d’Alzheimer (MA) n’ont toujours pas été élucidés et il n’existe toujours pas de traitement curatif. Pendant des années, les études portant sur l’apparition et les modifications pathologiques de la maladie d’Alzheimer ont été freinées par les limites des modèles expérimentaux de MA, jusqu’à la découverte révolutionnaire de S. Yamanaka des cellules souches pluripotentes induites (iPS). Ce nouvel outil offre l’opportunité unique de modéliser in vitro le phénotype de la MA, d’apporter de nouvelles connaissances sur les causes et de développer de futurs traitements de la maladie. Cette pratique n’est encore qu’à un stade précoce puisqu’aujourd’hui il n’y a que peu de publications reportant la caractérisation de neurones dérivés d’iPS MA. Cette revue s’intéresse à ces modèles innovants, les marqueurs clés de la pathologie, fait le point sur la caractérisation des iPS MA existantes, et discute les capacités des modèles à récapituler les signatures de la maladie.

La Maladie d’Alzheimer

La maladie d’Alzheimer est la principale forme de démence chez les personnes âgées et est devenue l’un des problèmes majeurs de santé publique. Elle est caractérisée par la perte progressive et irréversible des neurones, majoritairement corticaux, associée à un déclin cognitif et des troubles de la mémoire et du langage (Blennow et al., 2006).

La maladie est retrouvée sous forme familiale (MAF) ou sporadique (MAS). Les formes familiales sont des formes précoces, majoritairement d’origine génétique, car elles apparaissent relativement tôt lors du vieillissement, aux alentours de 65 ans. Des mutations causales, principalement à transmission autosomique dominante, sont associées à ces formes familiales. Plusieurs mutations ont été décrites dans le gène APP (Amyloid Precursor Protein), mais dans la majorité des cas qui provoque des phénotypes sévères de la maladie, on retrouve des mutations dans les gènes des présénilines (PSEN1 et PSEN2) (Blennow et al., 2006, et voir Physiopathologie). Ces formes familiales ne représentent cependant que 1 à 5 % des cas de la maladie d’Alzheimer et les formes majoritaires de la maladie sont les formes sporadiques (95 à 99 % des cas restants) qui sont par ailleurs plus complexes. En effet, les facteurs de risques sont mal connus et très variables. Ils relèveraient de la combinaison complexe de facteurs environnementaux, pathologiques et génétiques. Par conséquent, la maladie est difficile à prévoir, et le diagnostic précoce est rendu impossible en raison d’une apparition très tardive des symptômes. De plus, lors de l’examen de la maladie, une évaluation rigoureuse doit être mise en œuvre pour dissocier la MA des autres démences. Tous ces éléments expliquent les difficultés des médecins à établir un diagnostic précoce de la pathologie. Un deuxième point important à souligner est l’absence totale, à l’heure actuelle, de traitement curatif. Ceci se justifie notamment par la complexité particulière de la maladie et les lacunes existantes dans la compréhension de la physiopathologie comme souligné plus tôt.

Physiopathologie de la maladie

Les premières études réalisées sur des cerveaux post-mortem de patients atteints de la maladie d’Alzheimer ont révélé deux lésions histologiques caractéristiques : des dégénérescences neurofibrillaires intracellulaires et des plaques amyloïdes extracellulaires (Blennow et al., 2006).

Les neurofibrilles intracellulaires sont des agrégats composés de la protéine Tau hyperphosphorylée. Dans les neurones sains, la protéine Tau stabilise les microtubules. Dans la pathologie, Tau est hyperphosphorylée, ce qui conduit à la déstabilisation des microtubules et à l’accumulation de la protéine dans les neurones.

Les plaques amyloïdes ou ‘plaques séniles’ correspondent quant à elles à une accumulation d’agrégats de peptides β-amyloïde dans l’espace extracellulaire.

Les peptides Aβ résultent d’un clivage de la protéine APP (Amyloid Precursor Protein) qui a lieu en condition saine physiologique mais qui est exacerbé au cours de la pathologie Alzheimere. L’APP est une protéine transmembranaire, que l’on retrouve notamment à la surface de la membrane plasmique des cellules neuronales et au niveau des membranes des endosomes. Il existerait au moins deux voies distinctes majeures de clivage de l’APP. La voie non amyloïdogénique, majoritaire, met en œuvre deux clivages successifs réalisés au niveau de la membrane plasmique, par des α- et γ-sécrétases qui génèrent les fragments sAPPα, α-CTF, AICD et P3 mais pas de peptide Aβ. La voie amyloïdogénique, non majoritaire, met en œuvre, quant à elle les β- et γ-sécrétases qui génèrent les fragments sAPPβ, β-CTF, AICD et Aβ. Ce processus protéolytique s’effectue au niveau de la membrane des endosomes (Figure 1).

Figure 1 : Représentation dans les neurones des deux marqueurs clés impliqués dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer et leur voie d'apparition.

Les mutations causales retrouvées dans le gène de l’APP pourraient, pour certaines, favoriser un déséquilibre entre ces deux voies protéolytiques et conduire à l’accumulation des peptides amyloïdes. Les mutations causales sont localisées au niveau des gènes codant les présénilines 1 et 2. Ces enzymes font partie du complexe de la γ-sécrétase impliquée dans les processus de clivage de l’APP. La préséniline 1 (PS1, PSEN1) est responsable de l’activité catalytique de la γ-sécrétase. Il existe également une certaine corrélation entre une augmentation de son expression et une augmentation de la production des Aβ.

Suite au clivage de l’APP lors de la voie amyloïdogénique, plusieurs isoformes du peptide Aβ peuvent être générées selon le clivage de la y-sécrétase entre les résidus 38 et 43 du fragment β-CTF. La majorité des isoformes produites sont de 40 résidus (Aβ40), mais il est également retrouvé en faible quantité des formes de 42 résidus (Aβ42) (10 % de la production) de 38 résidus (Aβ38). La forme Aβ42 est l’une des isoformes les plus amyloïdogéniques et donc la plus pathogène.

Suite aux différents échecs pharmacologiques visant à empêcher la production des peptides Aβ, les nombreux efforts de la recherche, motivés par le besoin de mieux connaître la pathologie, se sont attachés à trouver des modèles de plus en plus pertinents.

La recherche de nouveaux modèles

Les recherches actuelles de traitement restent encore infructueuses dues à l’utilisation de modèles parfois trop éloignés de la physiologie et physiopathologie humaine. En effet la complexité de la pathologie humaine n’est pas toujours reflétée dans les modèles animaux ou cellulaires et il existe encore de nombreuses lacunes dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques. La majorité des modèles actuels pour la recherche sont des souris transgéniques, drosophiles ou autres invertébrés et des modèles de cellules non neuronales ou issues de neuroblastomes. Si ces modèles représentent de très bons modèles pour appréhender des mécanismes précis, ils ne sont pas, dans certains cas, pertinents surtout lorsqu’il s’agit d’étudier un phénomène existant uniquement dans contexte neuronal. Les souris apportent une complexité génétique certaine et peuvent présenter l’une ou l’autre des signatures caractéristiques de la maladie sur le plan neuro-anatomique. Elles constituent en conséquence de bons modèles pour les études génétiques puisqu’il est possible d’obtenir des lignées portant

un gène muté, et leur durée de vie relativement courte permet les analyses au cours du vieillissement. Elles offrent également l’opportunité de réaliser des analyses cognitives puisque de nombreux tests comportementaux sont disponibles comme par exemple l’étude de certaines formes de mémoires touchées lors de la maladie (mémoire à court terme et mémoire déclarative : mémoire épisodique). Cependant, la plupart des souris transgéniques ne présentent pas la totalité des caractéristiques neuro-anatomiques et neuro-anatomo-pathologique de la maladie humaine. Même si le déclin cognitif des souris corrèle avec certains aspects de la maladie humaine, de nombreux signes cliniques sont absents ou ne peuvent être évalués comme, par exemple, les troubles du comportement et de l’émotivité des patients. Les primates non humains (PNH) sont de très bons modèles pour l’étude du vieillissement et des pathologies neurodégénératives en raison de leurs nombreuses similarités avec les humains au niveau de leur anatomie, leurs structures cérébrales élaborées, et leurs fonctions cognitives. Par exemple, les microcèbes récapitulent naturellement les éléments majeurs de la pathologie tels que les plaques amyloïdes, une agrégation de la protéine Tau ainsi qu’une atrophie corticale (corrélés à des déficits de la mémoire spatiale) (Verdier et al., 2015). Toutefois, il existe encore des limites à de tels modèles puisque la disponibilité de ces animaux pour la recherche est limitée pour des raisons éthiques, de plus les études sur ces modèles génèrent des coûts élevés pour l’entretien des colonies sur une très longue période surtout lorsqu’il s’agit d’attendre leur vieillissement naturel dans le cas de la maladie d’Alzheimer.

De façon à continuer à progresser sur la pathologie, la recherche de nouveaux modèles plus pertinents, plus proches de l’Homme et comprenant moins de contraintes éthiques, est en perpétuel effervescence, notamment dans le domaine de la modélisation cellulaire. Si les cellules provenant des cerveaux post-mortem de patients, sont disponibles dans des banques de cerveaux, ces cellules sont mortes car les cerveaux ont été conservés de façon à réaliser des analyses anatomo-pathologiques et ne reflètent que le stade final de la maladie. Il est alors impossible d’étudier le fonctionnement des neurones atteints ou d’étudier les mécanismes sous-tendant la maladie, il est nécessaire de pouvoir accéder aux phases précoces des phénomènes d’agrégation des peptides Aβ, de Tau, ou de la neurodégénerescence. Ces différents éléments expliquent en partie pourquoi la recherche concernant le développement de traitement thérapeutique contre la MA, a subi, ces dernières années, de nombreuses déconvenues. Tout particulièrement

lors du passage en essais cliniques de médicaments pourtant jugés efficaces sur certains modèles animaux et cellulaires. Le modèle idéal serait des neurones humains vivants provenant de patients malades Alzheimer. Si ce genre d’outils paraissait incongru, ils sont maintenant disponibles grâce à la mise au point, par S. Yamanaka, d’une technique révolutionnaire de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC, pour human-induced Pluripotent Stem Cells). A l’origine, cette technique permettait d’obtenir, à partir de fibroblastes obtenus à partir de biopsie de peau de patients, des cellules souches pluripotentes. La reprogrammation consiste à placer, en culture, des fibroblastes de patient et à leur faire exprimer de façon transitoire, au moyen de vecteurs géniques un cocktail de gènes ‘dit de pluripotence’. Cette induction génétique permet de « réveiller » l’expression des gènes de pluripotence dits endogènes et par conséquent un retour vers un état de pluripotence pour des cellules complètement différenciées. Ces cellules sont génétiquement identiques aux cellules du donneur excepté les éventuelles mutations somatiques qui peuvent s’être accumulées. Les cellules obtenues ont, comme les cellules souches pluripotentes embryonnaires, la capacité de s’auto-renouveler et de se différencier en tous types de cellules des trois feuillets embryonnaires : Endoderme, Mesoderme et Ectoderme. Ce nouvel outil est apparu récemment comme une opportunité incontournable dans le domaine de la MA. Il a ainsi été possible d’obtenir des cellules pluripotentes à partir de fibroblastes de patients atteints de MA, de les différencier en neurones et d’obtenir ainsi des neurones « atteints » de la maladie d’Alzheimer.

Les iPSC dans la recherche de la maladie d’Alzheimer

Jusqu’à présent, les études se sont concentrées sur l’obtention des iPSC et leur différenciation en progéniteurs neuronaux ou en neurones fonctionnels en vue d’une application dans un grand nombre de pathologies. Des protocoles déjà établis par plusieurs équipes permettent maintenant de différencier des iPSC en plusieurs types neuronaux (dopaminergiques, cholinergiques, glutamatergiques, GABAergiques, sérotoninergiques) (voir Qiang et al., 2013).

Si la majorité des études publiées sur la génération d’iPSC Alzheimer s’est focalisée sur les formes génétiques, certaines ont également porté sur des cellules issues de patients atteints de la forme sporadique. Les différentes lignées iPSC des formes génétiques

s’attachent à différentes mutations existantes connues : les mutations de l’APP, duplications de l’APP, et les mutations des présénilines PSEN1 et PSEN2 (Tableau 1).

Tableau 1 : Tableau récapitulatif des différentes lignées iPSC MA générées Mutations APP Duplication de l’APP Mutations PSEN1 Mutations PSEN2 Cas sporadiques (18 lignées iPSC générées) Facteurs identifiés :

E693∆ APPDp A246E N141I CR10 (CNV dans CR1)

V717L M146L CR14 (CNV dans CR1)

Y115C Variant Trem2 p.R47H

H163R Variant SORL1

M146I FOXA1-FOXA2

Intron 4 ApoE3/E4

L150P A79V

Chacune des études, sur lesquelles nous allons nous attarder ci-après, s’est attachée à produire des neurones corticaux fonctionnels en culture à partir de cellules de patients. Une publication se différencie toutefois par la génération de neurones corticaux et d’astrocytes en co-culture (Kondo et al., 2013). Ce type de différence est important à prendre en considération compte tenu de la contribution importante, bien qu’encore débattue, qu’apportent les astrocytes dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer (pour revue, voir Rinaldi et Caldwell, 2013).

Toutefois, si les études se recoupent le plus souvent sur le type de neurones différenciés, il existe de nombreuses divergences dans la génération des iPSC, leur différenciation, le moment choisi pour les analyses ou encore le choix des marqueurs pathologiques étudiés. Ces différents points sont non négligeables et expliquent pourquoi il apparaît, à l’heure actuelle, difficile de réaliser une étude comparative approfondie des résultats obtenus dans les neurones MA.

Après avoir présenté les différentes techniques de reprogrammation, de culture et de différenciation utilisées par les quelques études publiées concernant l’obtention d’iPSC Alzheimer, cette revue tentera d’exposer les résultats actuels obtenus dans les iPSC MA et d’évaluer les similitudes et différences obtenues au niveau des marqueurs de la maladie en fonction des mutations d’origines.

Techniques de Reprogrammation

Tableau 2 : Tableau récapitulatif des techniques de reprogrammations en iPSC et des types cellulaires neuraux étudiés

Un premier aspect à prendre en considération est la technique de reprogrammation utilisée sur les fibroblastes obtenus à partir de biopsie de peau des patients. Yamanaka et son équipe avaient défini quatre facteurs géniques comme suffisants pour l’obtention d’iPSC : Oct3/4, SOX2, KLF4, c-MYC, (OSKM) (Takahashi et Yamanaka, 2006). Le vecteur utilisé lors de son étude était un rétrovirus (Morita et al., 2000). Depuis, de nombreuses études se sont intéressées à des techniques plus efficaces de reprogrammation. Il est

Publication Mutations / Lignées iPSC Transduction - Facteurs Type Cellulaire

PS1 - PS2 (Yagi, 2011) PS1-A246E , PS2-N141I ^{Vecteur plasmidique}

OCT4, SOX2, KLF4, LIN28, NANOG ^Neurones

PS1 ^(Sproul,

2014)

(FAD1) PS1-A246E, (FAD2) PS1-M146L

Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC ^{Progéniteurs neuraux, Neurones}

PS1 ^(Mahairaki,

2014) ^PS1-A246E

Vecteur épisomal

OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, LIN28, MYC + SV40LT

Neurones

PS1 ^(Duan,

2014) ^{PS1-A246E (AG06848)}

Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC

Neurones cholinergiques du prosencéphale basal PS1 (Liu, 2014) PS1-A246E, PS1-H163R, PS1-M146L Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC ^Neurones

APPDp (Israel, 2012)

APPDp Duplication de l'APP

Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC

Neurones (sous-types glutamatergiques, GABAergiques, cholinergiques) APP ^(Kondo, 2013) ^APP-E693Δ Neurones corticaux et astrocytes APP ^(Kondo, 2013) ^APP-V717L Neurones corticaux et astrocytes APP ^(Muratore, 2014) ^APP-V717L Vecteur lentiviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC ^{Neurones corticaux}

MAF ^(Duan,

2014) ^{Familial (AG07872)}

Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC

Neurones cholinergiques du prosencéphale basal MAS1 ^(Israel, 2012) -Neurones (sous-types glutamatergiques, GABAergiques, cholinergiques) MAS2 ^(Israel, 2012) -Neurones (sous-types glutamatergiques, GABAergiques, cholinergiques) MAS3 ^(Kondo, 2013) ^{AD3E211 , AD8K213} Vecteur épisomal

OCT4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC + shRNAp53 Neurones corticaux et astrocytes MAS4 ^(Duan, 2014) génotypes ApoE3/E4 (AG05810, AG04402, AG11414) Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC

Neurones cholinergiques du

prosencéphale basal

MAS5 ^(Hossini,

2015) ^NFH-46

Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC ^Neurones

MAS6 ^(Young,

2016) ^{13 lignées (ADRC)}

Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC

Neurones (sous-types glutamatergiques, GABAergiques, cholinergiques)

MAS

OCT4, SOX2, KLF4, LIN28, L-MYC + shRNAp53

Vecteur rétroviral

OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC

également possible, selon un protocole différent, d’induire un état de pluripotence des cellules avec seulement trois facteurs principaux : OCT3/4, SOX2 et KLF4 (Nakagawa et